[发明专利]白菜花粉壁发育相关基因PGBc2及其分离方法

权利要求书

1、一种白菜花粉壁发育相关基因PGBc2，其特征在于：它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的白菜花粉壁发育相关基因PGBc2，其特征在于：还包括在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

3、一种权利要求1所述的白菜花粉壁发育相关基因PGBc2的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)Bc-A8T18片段的分离：用A8/T18引物对白菜的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A8T18，用手术刀片割下聚丙烯酰胺凝胶上的差异片段，溶于100μL TE，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相同，PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化，回收产物连接到pGEM-T Easy Vector并转化到E.coli DH 5α感受态细胞。

经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列。

(2)Bc-A8T18片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端扩增：根据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物的特征设计3’RACE和5’RACE锚定引物P3和P5；根据差异片段Bc-A8T18设计正向特异引物S1和反向特异引物A1，正向特异引物S1与锚定引物P3扩增3’末端，反向特异引物A1与锚定引物P5扩增5’末端。锚定引物P5的序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；锚定引物P3的序列为：5’-GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3’；正向特异引物S1序列为5’-CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3’；反向特异引物A1序列为5’-CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3’；PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入pGEM-T Easy载体，转化DH 5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定后，测序，得到Bc-A8T18片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端。

(3)PGBc2基因的全长克隆：根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引物T1和T2，T1的序列为5’-TGGGATTTTCAGCCAATG-3’，T2的序列为5’-AGAGCATACATCATAGAC-3’；常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增Bc-A8T18片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增得到其DNA序列SEQ ID No.2。