[发明专利]一种检测恩诺沙星药物残留的胶体金试纸卡

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留的免疫化学速测技术领域，更具体地涉及一种检测恩诺沙星药物残留的胶体金试纸卡，借助胶体金标记显色的免疫层析反应，快速检测恩诺沙星药物残留。 

背景技术

恩诺沙星(enrofloxaicn，ENR)药物是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素。在化学结构上，本类药物属于吡酮酸衍生物(pyridonecarboxylic acids，PCAs)。抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，抗菌作用是磺胺类的近千倍，可与第三代头孢抗生素相媲美。因化学结构，价格低廉，故在医学上和兽医学中很快取得广泛应用。在兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，但由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关注。 

目前恩诺沙星药物残留常用的检测方法有两种。一种是色谱分析，如高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。 

胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay，GIGA)是将胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标金技术。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种敏感度高、操作简单、成本低的恩诺沙星药物残留快速检测试纸卡。 

本发明的试纸卡包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和 背衬，在上述反应膜具有包被有恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物。 

与常规试纸卡不同的是，本发明试纸卡的结合物释放垫并非完全覆盖在样本垫的下面，而是部分覆盖在样本垫的下面。这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。 

本发明将恩诺沙星-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜测试区内，并用胶体金标记恩诺沙星单克隆抗体，通过待测样本中的恩诺沙星药物和包被在反应膜上的恩诺沙星-载体蛋白偶联物共同竞争恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物，根据测试区条颜色深浅或有无红色条带来判断待测样本液中是否含有恩诺沙星残留。检测时，样本溶液滴入试剂卡孔内，当恩诺沙星在样本中浓度低于40ng/ml时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的恩诺沙星的偶联物结合，在测试区(T)和质控区(C)内各出现一条红色条带。如果恩诺沙星在样本中浓度高于40ng/ml时，胶体金抗体与样本中的恩诺沙星全部结合，从而在(T)区内因为竞争反应不与恩诺沙星偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在(T)区与(C)区内出现红色条带。如图2所示。 

阳性：当(C)区显示出红色条带，而(T)区不显色，判为阳性，表示恩诺沙星含量超过40ng/ml，用“+”表示。 

阴性：当(C)区显示出红色条带，(T)区同时显示出红色条带，且(T)带颜色接近或浅于(C)带时，判为阴性，表示恩诺沙星含量小于40ng/ml，用“-”表示。 

无效：当(C)区不显示出红色条带，则无论(T)区显示出红 色条带与否，该试纸卡判为无效。 

本发明还提供了制备上述试纸卡的方法，其包括步骤： 

1)制备包被恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫； 

2)制备具有包被恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜； 

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。 

具体地说，其步骤包括： 

(1)将恩诺沙星与载体蛋白偶联，形成恩诺沙星-载体蛋白偶联物； 

(2)用恩诺沙星-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 

(3)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体； 

(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；