[发明专利]一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

罗布麻是夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属(Apocynum)的一种多年生宿根草本植物，它包括罗布红麻(Apocynum venetum Linn)和罗布白麻(Apocynumhendersonii Hook.f.)。罗布麻无论在纤维利用、药用还是保健品开发方面均具有极高的综合利用价值。国内外现有的报道主要是关于罗布麻纤维脱胶技术的研究，而对前期的育种、生长特性和如何提高麻纤维质量的研究报道很少。由于罗布麻分枝较多，既影响种植密度，也难于实现机械化剥麻，直接影响了纤维长度和产量。野生资源已经远远无法满足不断增长的市场需求。目前，虽然进行了一些小规模人工种植试验，但分枝多，纤维短及产量低的问题仍然无法解决。因此，通过现代生物工程技术，利用转基因育种方法减少罗布麻的分枝，培育出分枝少、纤维产量高的新品种，提高麻皮的质量和产量，不但在控制植物分枝研究方面具有重要意义，而且所选育新品种的推广将会产生巨大的社会和经济效益。 

虽然目前对于其它植物的分枝发育调控国内外已有较多研究，但分枝控制涉及到十分复杂的植物激素调控和信号转导途径。随着一些分枝调控基因和转录因子的发现，为我们通过转基因技术实现对植物分枝的控制提供了可能。玉米的tblgene被认为是分枝调控基因(J.Doebley et al.Nature，1997，386，485-488)，此基因本身有抑制分枝的作用。另外，还有研究通过构建含有MADS-box基因的表达载体以实现增加农作物和观赏植物分枝的目的(United States Patent No.6995302)。在Ken-ichiro Hibara和Casper W.Vroemen等对拟南芥的研究中发现，CUC3基因对侧枝发育有重要作用(Ken-ichiro Hibara et al.The Plant Cell，2006，18，2946-2957；Casper W.Vroemen et al.The plant cell，2003，15，1563-1577)。CUC3基因属于NAC转录因子家族，它对侧枝的发育、器官原基边界的界定和顶端分生组织的形成发挥主要作用。在拟南芥中抑制CUC3基因，使拟南芥的侧枝生长受到抑制。最近的研究发现，在侧枝发育方面，CUC3起正调控作用。本发明将反义RNA技术应用于罗布麻，沉默罗布麻的CUC3基因，实现对其分枝的控制。 

反义RNA技术是通过与RNA进行碱基配对的方式从复制、转录和翻译等水平上对基因表达发挥调控作用。目前，反义RNA技术已经广泛应用于植物基因工程中，成为作物遗传改良的一个重要工具。目前利用反义RNA技术调控植物RNA技术已经渗透到植物学研究各个领域(孟博等.国外医学遗传学分册，2001，24(6)，289-292)，如：植物生长发育基因表达调控、农艺性状的改良(许本波等.中国农学通报，2003，19(3)，84-88)、次生代谢途径的调控和抗病转基因植物育种(娄红等，辽宁大学学报，2005，32(4)，328-333)，并获得了稳定转基因新品系，具有广泛的应用前景。目前还没有通过反义RNA技术沉默CUC3基因来控制罗布麻及其他作物和观赏植物分枝的相关报道。

虽然国内外已对罗布麻的组织培养进行了一些研究，但尚未建立稳定的再生体系。本发明通过发根农杆菌感染罗布麻外植体，可得到发根，从发根途径可直接得到再生植株，从而建立了罗布麻稳定的再生体系。与以往对罗布麻组培途径实现再生的研究相比，这种方法不易产生嵌合体植株，因此，是一种理想且稳定的转化和转基因植株再生体系。 

本发明通过构建CUC3基因的反义表达载体，利用发根农杆菌途径对罗布麻进行转化和实现转基因植株的再生，从而实现对罗布麻分枝的控制。本发明是一种对植物实现分枝调控的新途径，同时也为其他作物及观赏植物分枝性状控制提供了新的思路。 

发明内容

本发明的目的在于应用反义RNA引发的基因沉默技术，设计和构建罗布麻的分枝调控基因CUC3保守区基因片段的反义表达载体，导致该基因的沉默，抑制罗布麻的分枝发育，获得分枝少的罗布麻新品种。本发明提供了一种应用反义RNA基因沉默技术控制罗布麻分枝的方法，主要内容包括： 

1.罗布麻分枝调控基因CUC3保守区的克隆； 

应用RT-PCR方法，提取罗布麻总RNA反转录产生cDNA，以cDNA为模板克隆分枝调控基因CUC3保守区基因片段，并根据反义RNA基因沉默原理构建反义表达载体。