[发明专利]养血清脑颗粒对脑神经元损伤的预防作用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种中药制剂的新用途，特别涉及中药养血清脑颗粒对脑神经元损伤的预防作用。

背景技术：

脑损伤是多种损伤机制造成的共同结果，其中脑缺血最常引起神经细胞损伤。溶栓治疗和神经保护是治疗缺血性脑卒中的两大干预策略。溶栓治疗往往有治疗时间窗，且副作用较多。因此，神经元保护并与其他治疗方法联合应用表现出更明显的优越性。

养血清脑颗粒是由当归、川穹、鸡血藤、白芍、细辛等为主要成分组成的中药复方制剂，临床应用于与脑微循环障碍相关的头痛、眩晕治疗。但是，对大脑中动脉阻塞再灌注引起的大脑局部脑神经细胞的损伤是否具有保护作用等尚不清楚，为此，本研究用大脑中动脉阻塞再灌注建立的大鼠局部脑神经细胞模型，观察养血清脑颗粒对局部缺血再灌注后，大鼠脑神经元损伤的预防作用，并通过免疫组织化学方法研究养血清脑颗粒对调亡相关的脑神经元P53、PUMA、Bcl-2、Caspase-3表达的影响，探讨起作用机制。

发明内容：

本发明提供一种养血清脑颗粒的新的治疗用途，特别是用养血清脑颗粒预防脑神经元损伤。

养血清脑颗粒是一种已经上市的中成药物，其配方组成为：当归、赤芍、川芎、鸡血藤、勾藤、夏枯草等临床上用于治疗头痛、眩晕等症。

本发明经过研究发现，养血清脑颗粒可以预防脑神经元损伤因而扩大了其应用范围，为此，本发明的内容主要包括，用养血清脑颗粒制备一种预防脑神经元损伤的药物。

为证明本发明的实验效果，现将有关实验数据整列如下：

实验一、目的探讨养血清脑颗粒预防给药对大脑中动脉缺血再灌注后大鼠脑神经元损伤的预防作用。

材料和方法

1.实验动物及分组

雄性SD大鼠，体重300～350g，由北大医学部实验动物中心提供。随机分为假手术组(Sham组，n＝15)、大脑中动脉阻塞再灌注组(MCAO/R组，n＝15)、养血清脑颗粒0.4g/kg预防给药组(YXQ0.4组，n＝15)、养血清脑颗粒0.8g/kg预防给药组(YXQ0.8组，n＝15)。预防给药组于术前90min灌胃给予相应剂量药物。

2.药品、试剂及仪器

养血清脑颗粒(天士力集团公司)，规格4g×10袋装。SP-9000免疫组织化学试剂盒(北京中衫金桥生物技术有限公司)。羊抗P53多克隆抗体(Santa Cruz)。兔抗PUMA多克隆抗体(Cell signaling)。小鼠抗Caspase-3单克隆抗体(SantaCruz)。兔抗Bcl-2多克隆抗体(Santa Cruz)。仪器：石蜡切片机(AmericanOpitcal，美国)。显微摄像系统(Olympus BX51-DP70，日本)

3.大鼠线栓法缺血再灌注模型(MCAO/R)的制作

复合麻醉剂(3ml/kg)腹腔麻醉大鼠后取仰卧位，做颈部前正中切口，分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及翼腭动脉，用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉、结扎翼腭动脉，并在颈外动脉近心端、远心端分别穿线，远心端系紧，近心端系一个松结(备用)，在颈外动脉的两线间剪一个小口，将一预先制备好的栓线，经小口插入颈外动脉并送入颈内动脉，插入深度(距颈总动脉分叉处)为18.5mm±0.15mm。外留1cm长尼龙线，缝合皮肤。栓塞1h后拔除尼龙线，此时血流再通制成再灌注模型。术中用电热毯使大鼠保持恒定体温。术后出现左前肢偏瘫的大鼠进入下一步实验。

4.氯化三苯四氮唑(TTC)染色

各组大鼠5只，麻醉后剪下头部置于脑定位仪沿视交叉往后平均切成5片，用含2％TTC的磷酸盐缓冲液在37℃染色30min，然后再用4％多聚甲醛固定并拍照。用Image-Pro-Plus软件测量梗死比率(即梗死区体积占同侧大脑半球体积的百分比)。

5.光镜脑组织切片制备及Nissl染色

大鼠腹腔麻醉后，经左心室插管灌注。在相应的时间点将每组大鼠快速用生理盐水250ml(室温)灌注，再用4％多聚甲醛150ml(4℃)缓慢灌注，持续60min左右，迅速取脑，在脑定位模具中沿视交叉冠状位切取脑组织，将其置于4％多聚甲醛溶液中后固定6～8h后入30％的蔗糖中，待脑组织沉底后冰冻切片，制成20μm厚的切片，每隔5张切片取5张分别行常规Nissl染色，脱水封片后于光镜下观察。

6.免疫组织化学染色