[发明专利]流脑多糖联合疫苗及制备工艺

说明书

技术领域：

本发明涉及流脑多糖联合疫苗的制备方法，尤其是提供了流脑多糖联合疫苗制剂及制备工艺，用于脑脊髓膜炎重要疫病的免疫预防，属于疫苗生产制备技术领域。

背景技术：

流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，为急性呼吸道传染病。主要临床表现为发热、头痛、呕吐、皮肤粘膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征。重者可有败血症性休克和脑膜脑炎。此病发病急，病死率高，且在各年龄组中都可发生，15岁以下儿童发病占75％以上。为有效控制流行性脑脊髓膜炎的发生，应提前预防接种疫苗。

1984年Ambrosch等制备出A、C、W135和Y群四联流脑多糖菌苗，对成人志愿者免疫后，血清阳转率分别达到92.5％、92.5％、97.5％和95％，免疫效果是肯定的。WHO与1976年制定了单价A群和C群流脑多糖菌苗的制检规程，又于1980年进行了修订；补订了W135、Y群流脑多糖菌苗及A和C，A、C、W135及Y群二联和四联多糖菌苗制检规程。

适合中国人群的A、C、W135和Y群四联流脑多糖菌苗未见公开文献报道。

发明内容

本发明提供一种流脑多糖联合疫苗，具有一针多种免疫的功能。

本发明的流脑多糖(ACYW₁₃₅群)联合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量：

A群脑膜炎球菌多糖疫苗：         50μg

C群脑膜炎球菌多糖疫苗：         50μg

Y群脑膜炎球菌多糖疫苗：         50μg

W135群脑膜炎球菌多糖疫苗：      50μg

乳糖：                          2.5～3.0mg。

本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

1.菌种的的选用：选用A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备。

2.生产用菌种

启开工作种子批，经传代，经检定合格后，接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。

3.生产用培养基

采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。

4.培养

采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。

5.收获和杀菌

于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。

6.去核酸

将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2—8℃静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。

7.沉淀多糖

于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在—20℃以下，待纯化。

8.多糖纯化

将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml；按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15℃以下进行。

9.内毒素去除

取A、C、W₁₃₅、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2μm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。

10.半成品配制及分装

将检定合格的ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放2～8℃库待检。

11.冻干