[发明专利]分离与纯化单个病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒的分离与纯化方法，特别是一种基于原子力显微镜纳米操纵技术分离单个病毒的方法。

背景技术

对生物分子的分离分析一直是生物学研究的关键技术和重要内容。生命科学和生物技术的迅猛发展迫切需要在更加微观的尺度上(单细胞或单分子水平)将其分离进而获取相关生物化学信息的手段和工具(大学化学，2004，19：10-15)。近十年来，先后涌现出了各式各样可以分离微量甚至单个特定生物体的技术(分析试验室，2002，21：97-104)，主要包括流式细胞术(Cytometry，2000，42：284-289)、激光捕获显微分离(Science，1996，274：998-1001)、毛细管电泳(Journal of Chromatography B，1999，722：141-151)、双向电泳(Trends Food.Sci.Technol.，1995，6：51-58)、光镊(Trends Food.Sci.Technol，1995，6：51-58)、磁镊(Nature ReviewsMolecular Cell Biology，2000，1：130-136)、微流控芯片(Applied PhysicsLetters，2004，84：1786-1788)。由于技术局限，目前这些手段大多还处于分离单个细胞或者痕量分子，其分辨率也只有微米尺度，但对单个病毒和单个病毒的分离仍然是比较困难的，并且不能够定位分离。

原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)不仅是一种具有纳米分辨率的成像手段，而且也是一种可以进行纳米定位操纵的工具(Micron，2002，33：385-397)。人们先后尝试了用AFM探针分离微量甚至单个生物分子。如Heckl教授领导的研究小组于1997年率先实现了对染色体的特定区域的精确分离(J Struct.Biol.，1997，119：232-237)，但获得的物质是包括蛋白质与核酸等在内的混合物，无法每次都获得完全一致的样品；后来，Oesterhalt等用AFM针尖从嗜盐菌紫膜上分离出了单个蛋白质分子(Science，2000，286：143-146)，但问题在于事先要特定的抗体对针尖做修饰，其重复性也存在问题；2003年Osada等将AFM针尖插入到细胞内部分离mRNA，从而研究了基因在细胞内的表达情况，但这只能够通过随机黏附的方式来实现，无法准确定位，更不能保证每次分离的数量(Journal of Nanobiotechnology，2003，1：2)。Lu等用AFM针尖成功地实现了对单个DNA分子的定位切割和分离(J.Am.Chem.Soc.，2004，126：11136-11137)，但由于病毒大多为蛋白质外壳包被的颗粒，直径在几十纳米到几百纳米大小，要比蛋白质和DNA大很多，且十分易碎，但目前还没有用AFM来分离单个病毒的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是克服上述已有技术的局限，提供一种可对单个病毒分离与纯化的方法。

本发明所提供的一种单个病毒的分离方法概括地说就是采用纳米操纵技术分离单个病毒的方法。具体地说，该方法包括下列步骤：

(1)将病毒样品放置于平整的基底表面；

(2)利用可成像的分离装置对病毒样品进行成像，并获取其物理性质；

(3)根据物理性质不同选定单个病毒；

(4)用分离装置探针针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖扫描到病毒附近时，根据所要分离的病毒的物理性质，降低针尖到一定高度，使针尖与病毒接触并将病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。

所说的基底，最好是原子级平整的基底，可以是云母，也可以是硅，也可以是玻璃、也可以是石墨，还可以是化学修饰后的基底。

所说的病毒样品可以是经纯化或不纯化的病毒溶液，也可以是含有病毒的组织或细胞切片。

所说的单个病毒可以是病毒颗粒，也可以是裸露病毒。

所说的根据物理性质不同选定单个病毒，是根据病毒的形貌、大小、弹性选择。

所述使针尖与病毒接触并将病毒黏附在针尖上的步骤是通过推的纳米操纵，改变探针针尖的降低的高度来调节针尖与病毒之间的作用力而实现。

所说的分离单个病毒，可以是一次只分离一个病毒，也可以是连续分离单个病毒。

所述分离装置为原子力显微镜或基于原子力显微镜原理的装置。

所说的分离装置的探针可以经过修饰或不经修饰。