[发明专利]一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞的制备方法。

背景技术

原发性胃癌为我国高发的恶性肿瘤。在胃癌治疗历史上，手术切除是主要手段，但术后常复发。胃癌晚期(III期)患者，常缺乏有效的延长病人生命的治疗方法。若这些胃癌患者经一些有效的辅助治疗措施使胃癌肿瘤缩小后，再行切除，有可能使胃癌治疗有一个突破。

90年代新兴的肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗的重要措施之一，并被誉为继手术、化疗和放疗之后的另一种具有潜在前途的治疗方法。近年来肿瘤基因治疗的研究无论从深度上还是广度上都取得了很大进展。在获得美国重组DNA咨询委员会(RAC)、NIH专家委员会和FDA批准的基因治疗临床试验方案中，以肿瘤为最多，充分显示基因治疗在肿瘤研究中的迫切性。目前所开展的肿瘤基因治疗中，以肿瘤免疫基因治疗的研究为最多。肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗是以主动免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转导入肿瘤细胞中，以制备出免疫原性更强的新型瘤苗，并由于细胞因子的持续分泌，从而激发机体产生抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。研究表明，细胞因子基因治疗不仅在一定程度上克服了以往临床直接应用细胞因子需反复多次且副作用明显的缺点，而且也取得了直接应用所不具有的疗效。

白细胞介素-2是由活化T细胞所分泌的一种细胞因子，具有刺激多种免疫效应细胞活化的作用，包括T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等。在肿瘤免疫中起到重要作用。十多年前已开始将重组白细胞介素-2应用于临床恶性肿瘤病人。这种白细胞介素-2的系统性应用在黑色素瘤及其它一些肿瘤病人中取得一定的效果，报道有效率为15~20％。这种疗法主要是基于白细胞介素-2可使T细胞活化，从而有助于杀伤肿瘤细胞。然而由于白细胞介素-2在血液中的半衰期较短，而反复多次大剂量的应用又产生严重的毒副作用，因而限制了白细胞介素-2的临床应用。

1990年，两个研究小组分别报道了应用基因工程技术，将白细胞介素-2基因转导至肿瘤细胞。动物实验结果表明，可分泌白细胞介素-2的肿瘤细胞丧失了致瘤性。进一步观察发现，体内接种白细胞介素-2基因转导的肿瘤细胞后可抵抗后续野生型肿瘤的攻击。这些数据表明：(1)基因修饰的肿瘤细胞自身可与T细胞相互作用，(2)肿瘤细胞分泌的白细胞介素-2可替代辅助T细胞的作用，来激活肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞^[11]。类似的研究结果在多种肿瘤模型中相继得到证实，包括肠癌(CT26)、纤维肉瘤(CMS5)、肥大细胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3)^]等。

我们在动物肿瘤模型研究中也发现，白细胞介素-2基因修饰的小鼠肿瘤细胞H₂₂及MM45T.Li均显著降低其致瘤性，并能有效保护后续野生型肿瘤的攻击。

与此同时，在全世界范围内，应用白细胞介素-2基因工程瘤苗的临床试验不断获得批准，在细胞因子基因修饰肿瘤细胞的临床试验方案中，以白细胞介素-2基因应用最多。目前已有23个相关治疗方案获得批准，涉及到的肿瘤类型包括黑色素瘤、肾癌、肠癌、前列腺癌、头颈部肿瘤及肺癌等。

在所应用的基因转移系统中，逆转录病毒载体系统应用最早，对其研究也很深入。该系统最大的优点是可以前病毒形式稳定整合至宿主基因组中，从而使目的基因的长期稳定表达成为可能。尽管这种整合形式有可能导致宿主基因组的插入突变(insertion mutation)，但采用安全的ex vivo治疗方案，可使插入突变对机体带来的潜在危险降至最低。此外，作为第二代复制缺陷型逆转录病毒载体系统，LXSN系统更为安全，产生有复制能力的野生型病毒的可能性很小。该载体系统也是被美国FDA获得批准可应用于临床试验的载体之一。自1990年应用逆转录病毒载体于临床基因治疗以来，尚无发现该病毒的毒副反应报道。

本发明提供了一种白细胞介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立方法，为癌症的治疗提供了一种新的治疗途径。

发明内容

本发明提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞的制备方法。包括mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR扩增IL-2基因、IL-2cDNA的克隆、含IL-2重组逆转录病毒载体的组建、白细胞介素-2重组逆转录病毒包装细胞制备、人胃癌细胞株MKN-45的感染，白细胞介素-2表达活性的基因工程人胃癌细胞的建立。

附图说明

无。

具体实施方式

第一步：含信号肽的白细胞介素-2cDNA的制备。