[发明专利]蛇毒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛇毒指纹图谱的建立方法，以及由该方法所得的标准 图谱。

背景技术

蛇毒是从各种毒蛇蛇头毒腺中分泌的一类物质，作为毒蛇保护自己， 猎取食物的武器，是世界上最毒的动物毒素之一。蛇毒的主要成分是蛋白 质和多肽，约占干重的90-95％，其中包括多种酶，如磷酸酯酶、精氨酸 酯酶、蛋白水解酶、磷脂酶A2、类激肽释放酶、5-核苷酸酶、L-氨基酸氧 化酶及乙酰胆碱酯酶等。3-12种非酶活性蛋白质或多肽如：神经毒素、膜 活性肽、舒缓激肽增强肽、出血因子等。这些有活性的成分中很多具有药 理作用和药用价值，如蛇毒中的类凝血酶、纤溶酶已在临床上作为抗栓药 用于血栓病的防治。此外，蛇毒中还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化 合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒的成分因蛇的种类、产 地、时间、蛇龄、雌雄、生存环境等不同而有明显的不同。

蛇毒是人类迄今为止研究与利用最多的动物毒素，但其早期研究却是 很艰苦的，主要是因为蛋白质的分离、纯化比较困难。70年代以后，随着 分子生物学突飞猛进地发展，借助于先进的生物技术手段，才得以对蛇毒 各组分的化学本质进行研究，并进入以结构与功能为主的分子水平。随着 生物技术的迅猛发展，加之对天然物质的重视，对蛇毒有效成分的研究已 相当深入，单一组分及其分子生物学性质研究已开始进行一级结构和基因 表达的工作，单组分制剂在临床上已使用多年并取得很确切的疗效。

全世界现有的蛇类大约有13科、400属、2700多种，其中四分之一是 毒蛇。我国蛇类资源十分丰富，大约有8科、53属、219种(包括亚种)。其中 毒蛇约50余种，但有剧毒而危害较大的不过10余种，即：金环蛇、银环蛇、 眼镜蛇、眼镜王蛇、圆斑蝰蛇、草原蝰蛇、蝮蛇、尖吻蝮蛇、竹叶青、烙 铁头、山烙铁头。我国的蛇毒研究起步较晚，大约是在80年代初，国内先 后在广西、福建、昆明、安徽等成立了研究室，从蝮科、眼镜科、海蛇科 等20多种毒蛇的蛇毒中分离、纯化了多种成分。国内现在也开展对蛇毒成 分分子结构与功能方面的研究，但研究规模与深度和国外相比，还有一定 的差距。

蛇毒中的主要成分是蛋白，多肽，及酶类等生物活性物质，其本质是 由氨基酸所组成的蛋白质。目前国内对于蛇毒的研究，大多集中在其中某 些具体活性组分，比如降纤酶，纤溶酶，以及一系列神经毒性因子等等。 而针对蛇毒整体进行的指纹图谱研究尚未见报道。90年代以来韦世秀等利 用等速电泳技术对眼镜蛇毒、蝮蛇毒和五步蛇毒进行分析鉴别，并对蛇毒 冻干粉与新鲜蛇毒液进行对比研究；还对蛇毒掺伪品进行了鉴定分析，结 果表明不同蛇种、不同产地的蛇毒或蛇毒掺伪品，因其组分、含量各异， 表现在等速电泳图谱上的不一致；而同种蛇毒的冻干粉与新鲜毒液的电泳 图谱几无差异。该研究表明应用等速电泳技术对蛇毒进行鉴别分析，将对 蛇毒的质量监控发挥重要的作用。虽然该法是一种有效的分析方法，但由 于仪器、试剂等方面的限制，在我国应用并不普遍。

曹金鸿等用交叉免疫电泳法对白眉蝮蛇毒、黑眉腹蛇毒、五步蛇毒、 竹叶青蛇毒和烙铁头蛇毒的鉴别进行了研究。由于各种蛇毒共有组分种类 不同以及各组分相对含量的不同，电泳图谱中沉淀线位置及峰相对高度比 等各不相同，可用于区分不同的蛇毒。但该方法需要提前准备相应蛇毒的 抗血清，具有相当的局限性。仓公敖等利用双向免疫电泳法，结合相应蛇 毒抗血清，也完成一定的蛇毒鉴定工作。

但是，由于以上电泳方法自身重复性不佳和分辨率低下，已经不能适 应当前蛇毒研究的需求。新的分析手段亟需被运用到研究中来。

指纹图谱技术源于指纹鉴定学。常用于中药研究，是一种综合的、宏 观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成药进行鉴别真伪，评价原 料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性是“整体性” 和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊 性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性。

毛细管电泳作为一种日渐成熟的分离方式，具有用样量少，环境友好， 理论踏板数高，分辨率高等优点。常可与高效液相色谱(HPLC)互补， 作为指纹图谱的研究手段。目前国内运用毛细管电泳分离的对象大多局限 于小分子，清华大学张宣等尝试运用微乳液毛细管电动色谱的方式针对蛋 白质的分离条件进行过初步探讨，但尚未见推广运用。