[发明专利]通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法

说明书

技术领域

本发明属于草酸脱羧酶活力的测定方法，特别是涉及一种通过测定酶反应产物二氧化碳浓度来确定草酸脱羧酶活力的方法。

背景技术

目前草酸脱羧酶活力的测定方法主要有HPLC法、分光光度法、测压法等。酶的活性可以通过测定底物草酸分解产生的甲酸的量、二氧化碳的量或者草酸分解减少的量得到。甲酸的测定可以用HPLC或甲酸脱氢酶法，二氧化碳的测定可以通过测压计测定，草酸的测定可以通过HPLC或草酸氧化酶法测定。HPLC方法主要是对仪器和样品的要求比较高，不利于推广；酶法测定中的草酸氧化酶因为产率较低，售价昂贵，也不利于进一步推广。

1980年Beutler等人以草酸为底物，加入氧化型辅酶I(NAD⁺)以及甲酸脱氢酶，用紫外分光光度法在340nm处测定其吸光值从而得到甲酸的量。经过许多学者的改进，现在的经典方法如下具体所述：

(1)在0.3mL 0.2M醋酸缓冲液(pH 5.6)中加入0.1mL 50mM的草酸溶液和0.1mL(v)的草酸脱羧酶液，反应液最终pH为3.0，37℃条件下反应30min(T)；

(2)然后加入2mL氧化型辅酶I和0.3mL的去离子水，继续在30℃下反应2min，终止酶促反应，用紫外-可见光分光光度计在340nm处测定反应液的吸光值A₁；

(3)再加入0.2mL的甲酸脱氢酶(约5.27U/mL)，反应液最终体积(V)为3mL，在同样的温度下，反应30min，在340nm处测定反应液的吸光值A₂，得ΔA＝A₂-A₁；

(4)按照公式(2)计算草酸脱羧酶的酶活，一个酶活单位定义为在30℃pH 3.0，一个大气压下，每分钟生成1μmol甲酸的量。体积酶活单位为U/mL。

公式(2)

V——最终体积(mL)

T——反应时间(min)

v——待测粗酶液体积(mL)

d——光路直径(cm)

ε₂——NADH在340nm处的吸收系数(6.3L·mmol^-1·cm^-1)

这种方法简便、精确度高，是目前测定草酸脱羧酶的经典方法。但这种方法存在耗时长、成本高的缺点，如第二步添加甲酸脱氢酶后的酶反应时间需要半小时，较耗费时间；所用的甲酸脱氢酶由于产量低等原因，价格昂贵，使测定草酸脱羧酶活力的成本大大增加。因此大家都在寻找一种能替代这种经典方法，且耗时短、价格较便宜、精确度与该方法相近的测定草酸脱羧酶活力的方法。

由草酸脱羧酶的催化反应可以知道该酶活性也可以通过测定其反应产物二氧化碳的量来得到。二氧化碳的测定可以利用测压计法和酶法。测压计法繁琐，且对仪器要求高，而酶法是一发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，该法通过测定酶反应产物二氧化碳的浓度的变化得到草酸脱羧酶活力，这种测定方法与经典方法相比，精确度相近，耗时短，价格相对便宜，有很好的实用性。

本发明的一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括步骤：

(2)第一步酶催化反应体系——草酸脱羧酶催化降解草酸生成甲酸和二氧化碳

空白组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL 50mM草酸和0.1mL处理失活(沸水浴15min-20min)的草酸脱羧酶酶液

待测样品组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL50mM草酸和0.1mL待测草酸脱羧酶酶液底物(v)

第一步酶催化反应体系总体积(V₂)为0.5mL，反应pH为3.0～3.7，反应温度为30～37℃，反应时间(T)为30～60min；

(2)第二反应体系

空白组和待测样品组都为：1.0mL CO₂试剂，其CO₂试剂的组成为8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM还原型辅酶I(NADH)、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的苹果酸脱氢酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.3～8.5)；

第二反应体系在30～37℃温育5～10min，380nm条件下测定A₁；

(3)第三反应体系