[发明专利]基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的测定，特别是一种基于磁珠及纳米金探针的高灵敏度微量蛋白质的测定方法，可应用于医学领域。

背景技术

酶联免疫反应(ELISA)在临床实验室已得到普遍的应用，可用于检测各种肿瘤标志物、细胞因子、病毒标志物等各种蛋白质，目前也已有多种市售的ELISA试剂盒。但是，ELISA法操作程序复杂，步骤多，尤其是时间较长，需要5、6个小时，给临床应用带来一些不便。如果缩短检测的时间，则会降低检测的灵敏度，达不到临床所需要的检测要求。因此，为满足临床快速检测的需要，研发快速、高灵敏度的蛋白质检测方法是近几年的研究热点。

随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的成就，为生物医学的发展提供了新的契机。纳米材料具有传统材料所不具备的特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。对于小尺寸的磁珠来说，当外加磁场时，磁珠会被磁化并吸附在磁极上，而撤去外加磁场时，磁珠的磁性消失，磁珠重新分散在溶液中，而不是聚集在一起。由于纳米磁珠对外磁场具有良好的响应性，因此可以通过外磁场作用，利用纳米磁珠进行生物样品的分离和定位等操作，从而实现生物传感器系统的集成化和自动化。作为标记材料而广泛应用于免疫检测中的纳米胶体金颗粒对生物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合，因而在生物医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳米金颗粒标记技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只需普通光学仪器，甚至肉眼即可辨别。鉴于以上优点，开发基于磁珠和纳米金粒子的检测技术已成为当今研究的热点，特别适合于广大基层单位、医院、及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磁珠和纳米金探针的微量蛋白质的测定方法，也即本发明要解决的技术问题主要是开发一种微量蛋白质的高灵敏度的快速测定方法。

本发明主要内容包括：首先用待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠，在纳米金上标记上待测蛋白质的多克隆抗体，在纳米金上同时还标记一种带有生物素标记的DNA探针，纳米金上的DNA探针通过生物素-链亲和素反应，又标记上了辣根过氧化酶Horseradish Peroxidase(HRP)，组成纳米金探针，将标记好待测蛋白质单克隆抗体的磁珠及纳米金探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针，用四甲基联苯胺3，3′5，5-Tetramethylbenzidine(TMB)显色系统进行显色，从而达到对待测蛋白质进行定量测定的目的，具体测定流程见图1。

主要包括以下具体内容：

一、所用试剂及材料：

1.羧基修饰的磁珠：购自Dynal公司，直径1-3μm。

2.0.1M磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2)组成为：137mmol/L NaCl，2.7mmol/LKCl，4.3mmol/L Na₂HPO₄.7H2O，1.4mmol/L KH₂PO₄。

3.0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.2)：0.2M Na₂HPO₄，0.2M NaH₂PO₄

4.杂交缓冲液：0.1MPBS、0.5％牛血清白蛋白BSA(质量％)、0.05％Tween20(体积％)。

5.洗液：0.1MPBS、0.1％BSA(质量％)、0.05％Tween20(体积％)。

6.TMB显色液，购自上海科华生物有限公司。

二、具体的实施方式：

1待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠

1.1活化磁珠：选用羧基修饰的磁珠，用300-500μl 25mM2-[N-morpholino]ethane sfonic acid(MES)溶液(pH6)清洗300-500μl磁珠(相当于3-5mg磁珠)两次，加冰浴的50mg/ml碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride EDC)溶液40-60μl、50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide NHS)溶液40-60μl，室温孵育30min；再用300μl 25mM MES溶液(pH6)洗两次。