[发明专利]基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的用于电泳的样品制备方法，特别是一种基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法。

背景技术

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。已经被广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。电泳的分辨率是最重要的指标之一。

毛细管电泳技术，又称高效毛细管电泳或毛细管分离法，是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。其基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为20～100μm的毛细管为工具，其内填充有交联的聚丙烯酰胺凝胶或聚二甲基丙烯酰胺、线性聚丙烯酰胺、聚环氧乙烯等聚合物作为分离介质。

基于毛细管电泳原理的测序仪是一种重要的DNA分析手段，常规的测序仪一般每次读取DNA序列的长度为500个碱基(nt)左右，并且对复杂序列(如GC重复序列，单串联序列等)往往测序质量很差，得到的序列很短，甚至根本得不到有效结果。如何提高测序的长度以及测序的质量不仅决定了测序的成败，而且直接关系到测序成本的高低。

近年来，在毛细管电泳中的分离介质中加入各种添加剂以改善其筛分能力、粘度和自涂敷功能是最常用且非常有效的手段。

经对现有技术的文献检索发现，Zhou等在《Electrophoresis》(电泳)(2007年28期1072-1080页)上发表的“Novel quasi-interpenetrating network/glodnanoparticles composite matrices for DNA sequencing by CE”(用于毛细管电泳DNA测序的新型准互穿聚合物网络/金纳米粒子复合介质)，该文中提出含有胶体金粒子的溶液作为分离介质来分离DNA片段和测序，具体方法为：将具有自涂敷功能的准互穿聚合物网络与胶体金混合，得到准互穿聚合物网络/金纳米粒子复合介质，来分离DNA片段和测序，具有快速，分离能力高，重复性好等特点。其不足在于：要经过复杂的化学方法将胶体金粒子引入到用于DNA分离的聚合物中制备复合介质，还要将其事先装如毛细管中。不仅制备过程复杂，而且在使用过程中不能根据使用目的进行调整和改变。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于纳米颗粒提高电泳分辨率与测序质量的方法。本发明可以提高电泳的分辨率和毛细管电泳测序质量与有效测序长度。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在上样过程中在样品或上样缓冲液中添加胶体金，一方面，胶体金粒子可与单链DNA分子结合，不仅可以富集DNA分子，而且可以增加DNA移动的速度；另一方面，胶体金粒子在毛细管中的聚合物网络中形成交链点，从而增强了分离的有效性。通过使用不同直径和浓度的胶体金使有效测序长度和质量达到最佳。

所述胶体金，其粒径为5nm～60nm，用量为0.001nmol/L～1nmol/L。

所述胶体金，其粒径为10nm时，用量为0.1nmol/L～1nmol/L。

所述胶体金，其粒径为20nm时，用量为0.03～0.4nmol/L。

所述胶体金，其粒径为30nm～60nm时，用量范围为0.001nmol/L～0.03nmol/L。

所述的胶体金，可以是商业购买的，也可以是自行制备的，制备可以有多种方法，如白磷还原法、柠檬酸纳还原法、柠檬酸纳-鞣酸还原法都可用于制备胶体金。例如参照Freas在1973年创立的柠檬酸三纳还原法，先将0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1％柠檬酸三纳水溶液，开始是蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色即可，所有溶液采用灭菌后纯水配置。对粒径大小没有限制，使用前不需稀释。

本发明积极进步的效果在于：本发明使用简单，应用广泛，对电泳有显著增效效果等优点。具体表现在，1)与目前所使用的将胶体金制备成复合介质的方法相比，本发明的方法极为简单，使用方便，可根据实际需要使用不同大小和/或浓度的金纳米颗粒以实现不同的测序目的；2)本发明可以应用于任意厂家和型号的测序仪上，并且提高测序长度为100～1000nt，从而可降低测序价格20％以上。3)本发明可以明显改善富含GC等DNA复杂序列的测序效果。

附图说明