[发明专利]一个新的人类睾丸特异性基因TDRG1

说明书

技术领域：

本发明涉及人类基因，具体是一个新的睾丸特异性基因TDRG1的cDNA全长克隆，并明确了该基因编码的氨基酸序列以及在人体多种组织、不同发育阶段睾丸组织中的表达谱。

背景技术：

根据WHO(1986)人类生殖研究发展和培训特别规划署研究报告，在发达国家不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，而男性不育又占不育夫妇的43％。研究表明，男性不育发生和发展是一个多基因参与的过程，约2000个不同的基因参与了男性生殖及其调节过程，包括：睾丸发育、生殖细胞分化、减数分裂以及精子发生的各个阶段。这些基因有的位于性染色体，有的则定位于常染色体。因此，发现和研究与生精相关的新基因，成为了进一步揭示男性生精过程的分子机制的关键，也可能为诊治男性不育症提供新的思路。

人类基因组图谱公诸于世后，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签(expressed sequence tag，EST)和生物信息数据库，对人类基因组未知功能新基因的发掘和蛋白质功能分析已成为近年研究的热点。美国NCBI的Unigene数据库中拥有大量的EST，它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理状态下所构建的cDNA(complementary DNA)文库，已成为人们寻找新基因的重要标志物。运用：“数据库消减杂交”(Digital Differential Display，DDD)方法对不同文库进行比较，获得在统计学意义上存在明显差异的代表新基因的克隆重叠群，并结合实验验证克隆新基因的方法是目前发掘新基因的常用手段之一。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一个新的睾丸特异性基因TDRG1的的cDNA全长序列，并明确了其编码的氨基酸序列，分析它在人体多种组织和不同发育阶段睾丸组织中的表达谱，以探索该基因在睾丸生精过程中所起的作用，进而开发治疗男性不育症的基因药物。

经互联网进入美国NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Unigene数据库，运用DDD方法进行数种平行材料之间的比较。以9个人类睾丸cDNA文库作为检测子(pool A)，76个其他组织或细胞株(如心、脾、肝、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、骨骼肌、胸腺、前列腺、小肠、大肠等)来源的cDNA文库作为驱赶子(poolB)，通过pool A：pool B之间的比值来计算倍数差异，并以≥10倍的差异为筛选标准，经数据库消减杂交筛选获得可能存在表达差异的EST片段。选取了其中一个电子预测其可能在睾丸组织中特异表达的代表新基因的克隆重叠群(contig)Hs.180197，该EST族中包含BC071820.1、BC033995.2和BC042123.1，3个序列拼接后获得一条长度为1197bp的新序列。

以拼接后的新序列为探针，运用多种基因预测软件搜索EST和Unigene数据库，经互联网进入美国GenBank数据库，利用BLAST检索nr数据库和EST数据库进行归类、拼接、延长、查新，获得受人类基因组图谱支持的新基因的cDNA全长为1197bp。

以成人睾丸组织的总mRNA为模板，进行逆转录。依据电子克隆的新基因序列设计两对引物(P₁/P₂，P₃/P₄，见下文)在成人睾丸组织的cDNA文库中进行PCR扩增，以2％琼脂糖电泳检测PCR产物大小。将经琼脂糖电泳验证的PCR产物连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌JM109。重组克隆在AB1377-3自动测序仪上完成测序。结果表明两对引物均扩增成功，实验扩增产物的测序结果与电子克隆所获得的基因序列完全一致，从而实验验证了该基因在成人睾丸组织中的表达。

对睾丸、心脏、肝脏、脑、附睾、肺、肾、脾等人正常组织进行多组织半定量RT-PCR分析，结果表明该新基因仅在人睾丸组织中表达。多组织半定量Northern杂交分析亦显示仅在睾丸组织中有约1.19kb大小的阳性转录本存在。说明新克隆的基因为睾丸特异性表达的基因。用半定量RT-PCR分析新基因在人类不同发育阶段睾丸组织中的表达，发现新基因在4个月和6个月的胎儿睾丸中无表达，在15岁少年睾丸中强表达，在33岁青年睾丸中表达稍减弱，而在74岁老年男性睾丸组织中的表达明显减弱，从而提示该基因与男性性成熟与生精功能有关。因此，我们将该新基因全长cDNA序列提交到GeneBank，登录号为DQ168992，经国际人类基因命名委员会批准命名为TDRG1(Testis DevelopmentRelated Gene 1)。