[发明专利]葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒及定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种葡萄球菌蛋白A定 量检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

葡萄球菌蛋白A的发现从一开始就与IgG(免疫球蛋白G)相关联，早在 1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种在双向扩散试验中能 与正常人血清形成沉淀的物质。Jensen(1959)也发现类似现象，并将其命名为 A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与 糖相区别，Grov(1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称葡萄球菌蛋白A或 SPA。1978年，有研究者将加热灭活并经福尔马林固定的金黄色葡萄球菌用于一 种癌症的治疗，显示出一定的疗效，这是世界上第一次利用葡萄球菌蛋白A的 抗体吸附性治疗相关疾病的报道。Uhlen等在1984年阐明了葡萄球菌蛋白A的 全基因序列和相应的氨基酸序列。2003年，L.Yang等应用表面张力探针证明每 个葡萄球菌蛋白A分子可结合两个IgG分子。

葡萄球菌蛋白A的基因编码序列由1464个碱基组成(若加上氨基端信号肽 序列则为1572个碱基)，共编码488个氨基酸，分子量约42KD。整个葡萄球菌 蛋白A分子包含六个结构域：E、D、A、B、C和X(从氨基端至羧基端)，其 中，E、D、A、B、C这五个结构域均具备结合IgG的能力。X结构域的作用是 将葡萄球菌蛋白A嵌合入金黄色葡萄球菌的细胞壁。

葡萄球菌蛋白A可与人类和哺乳动物血清中的免疫球蛋白分子Fc段结合， 特别是IgG和含IgG的免疫复合物，这是一种非免疫反应性结合，具有高度的 亲和力。葡萄球菌蛋白A的应用主要基于其抗体结合能力。将葡萄球菌蛋白A 通过化学方法交联至各种支架结构上，如与琼脂糖凝胶共价耦合，能耐受温度、 pH变化和变性剂的作用而不脱失。这种由葡萄球菌蛋白A和琼脂糖凝胶合成的 填料可用于抗体的分离纯化。随着免疫吸附血液净化治疗技术的快速发展，这种 合成填料逐渐被应用于自身免疫疾病、恶性肿瘤、移植排斥等疾病的治疗，当患 者血浆通过时，基质中葡萄球菌蛋白A可与血浆中致病性抗体，特别是IgG型 抗体结合，这是一种可逆性、pH敏感的结合，将pH降至2.3～2.5时，葡萄球 菌蛋白A与所结合抗体解离，抗体被洗脱清除，将pH恢复至7.0时，葡萄球菌 蛋白A又恢复吸附能力，这样可不断重复循环吸附致病性抗体，从而达到治疗 疾病的目的，这种免疫吸附的方法称为葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Protein A  Immunoadsorption，PAIA)。

在葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的使用过程中，吸附柱内结合不牢固的葡萄 球菌蛋白A可能会随着血浆的流动从吸附柱上脱落，如果这些脱落的葡萄球菌 蛋白A通过血液进入人体并积累到一定量时很可能会对人体造成伤害并引发免 疫系统的相关症状，因此对脱落葡萄球菌蛋白A含量的检测是葡萄球菌蛋白A 免疫吸附柱产品的质量保证和在临床上使用的安全保证。

本发明利用ELISA技术建立了可定量检测微量葡萄球菌蛋白A的试剂盒， 该试剂盒适用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱脱落的微量葡萄球菌蛋白A的检测， 具有灵敏度高、准确性和稳定性好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，该试剂盒通过 使用人工重组的葡萄球菌蛋白A(SPA)作为标准品以及用人IgG作为包被ELISA 板的抗体，使试剂盒的原料来源方便，制造成本和推广成本更低。

本发明所述的一种葡萄球菌蛋白A定量检测试剂盒，包括：

包被有人IgG的ELISA板；

葡萄球菌蛋白A标准品，包含人工重组的葡萄球菌蛋白A即SPA，该重组蛋 白具有如序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，分子量约27kd，纯度95％ 以上；

生物素标记的抗SPA抗体；

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin/HRP)；

常规的样品稀释液，例如，稀释液的组分为：1×PBS，0.1％BSA，0.05％ Tween-20，pH 7.2±0.2；

常规的洗涤液，例如，洗涤液的组分为：1×PBS，0.05％Tween-20；

常规的显色液，例如TMB显色液；

常规的终止液，例如，终止液的组分为：2mol/L H₂SO₄。