[发明专利]一种干细胞无毒冻存液

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于保存干细胞的冻存液。

背景技术

干细胞移植已成为当今医学领域生物治疗应用研究的热点。为了满足移植的需要，建立干细胞库，长期妥善保存干细胞，已引起研究者们的广泛重视。干细胞的保存方法直接影响细胞的存活率及移植后的效果。目前，临床上唯一可以实现干细胞长期保存的方法就是超低温保存。超低温保存是将生物标本冷冻至-80～-196℃的低温，利用细胞内新陈代谢减慢乃至停止的特性，从而实现较长时间的保存。超低温保存过程具有几个关键性的环节，如：低温保护剂的选择与加入、冷冻方案、保存温度以及复温过程。关于选用何种保护剂、如何降温并保存、以及如何复温等，尚未存在统一的方案，还有待进一步研究。

目前，干细胞的超低温保存主要有两种方法：-196℃程序冷冻液氮保存和-80℃低温冰箱直接保存。前者可以实现长期的安全保存，但是程序降温过程耗时较长并且操作复杂；后者虽操作简单费用低，但不适合长期保存，同时还会受到停电的影响。

低温保护剂是干细胞低温保存必不可少的添加剂，主要用于抑制细胞内外冰晶的形成，保护细胞免受冷冻损伤。低温保护剂可分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。渗透性保护剂多是一些小分子物质，如二甲基亚砜(DMSO)，可渗透进入细胞内部，抑制细胞内结冰，保护细胞内部结构；非渗透性保护剂，如羟乙基淀粉，主要用于抑制细胞外结冰，保护细胞膜。DMSO是干细胞保存最常用的保护剂，10％DMSO可用于干细胞长期保存，5％DMSO联合6％羟乙基淀粉，也已经成功用于造血干细胞的移植。尽管如此，干细胞对DMSO较为敏感，冷冻前和复温后，应尽可能缩短与DMSO接触的时间。通常情况下，人们的做法是，干细胞加入保护剂后迅速冷冻，复温后直接移植进入患者体内。然而，临床研究表明，DMSO具有很高的毒副作用，通常使接受移植的患者产生恶心、呕吐、腹痛等症状；除此，对心血管、呼吸系统、中枢神经以及肾脏等也会产生副作用。解决这一问题的关键是减少保护剂的毒副作用、提高复温后的细胞活性。因此，使用对人体无毒的低温保护剂长期安全保存干细胞，具有极大的研究价值和应用前景。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种对人体无毒，能长期安全保存干细胞的无毒冻存液。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种干细胞无毒冻存液，每100毫升溶液中含有：

聚乙烯醇     0.1～5克

1，2-丙二醇  1～30克

余量为水。

其优选的比例是每100毫升溶液含有：

聚乙烯醇     1～5克

1，2-丙二醇  10～20克

余量为水。

本发明采用1，2-丙二醇(PE)为渗透性防冻剂，结合聚乙烯醇(PVA)作为非渗透性保护剂用于低温保存干细胞。

PVA作为非渗透性保护剂，可通过抑制细胞外溶液形成冰晶，维持细胞内外渗透压差，从而达到保护细胞膜的目的。PVA用于低温保存，具有以下优点：

1.分子链上含有丰富的羟基，具有很强的水合能力；

2.分子量大，增加少量的PVA，就能使溶液的粘度增大，提高溶液的玻璃化转变温度；

3.在降温过程中，PVA能够延迟溶液结冰，一旦溶液中形成冰晶，PVA分子会吸附在冰晶表面，抑制其长大和重结晶的发生。

4.PVA的重结晶抑制活性在复温过程中对于保护细胞膜发挥重要的作用，原因是溶液在升温过程中，只要温度低于熔点，水很容易形成冰晶，或者原有的冰晶很容易长大或者发生重结晶，大冰晶的形成，对细胞膜造成的机械损伤是致命的。因此，PVA的存在，能够阻止大冰晶的形成，降低对细胞膜的破坏，起到保护细胞的作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.与已公开的干细胞冻存液相比，本发明的冻存液同时含渗透性和非渗透性低温保护剂，尤其采用聚乙烯醇为非渗透性防冻剂组分，具有明显的阻止冰晶生长及抑止重结晶作用，可以有效形成低温玻璃化冻存效果。

2.本发明的玻璃化冻存液体系同时考虑了保护剂的毒性、渗透性、玻璃化能力、玻璃化稳定性以及升温降温速率等因素。所以不只在降温过程中易于进入玻璃化状态，而且还能保证玻璃化溶液在升温过程中的稳定性。而现有冻存技术中玻璃化溶液从低温保存状态平稳复温到常温状态是较难实现的。

3.本发明的多组分冻存液具有简单而且通用的效果，适于各种细胞、组织及器官的玻璃化冻存。