[发明专利]从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒及使用该试剂盒提取造礁石珊瑚共生虫黄藻基因组DNA的方法。

背景技术

珊瑚礁具有极高的生物多样性，全世界海洋生物中有25％生活在珊瑚礁，有“海洋绿洲”或“海洋热带雨林”之称，其社会经济价值不可估量。珊瑚礁生态系统具有极丰富的生物资源，是渔业的繁殖基地，为人类提供重要的食物和药物资源；海底的珊瑚礁，风景秀丽，更是有名的海底花园，是人们极好的潜水旅游圣地。因此珊瑚礁的保护和可持续利用日益引起人们的关注，例如我国目前已经成立海南三亚珊瑚礁国家自然保护区和广东徐闻珊瑚礁国家自然保护区，由科研人员或者海洋保护管理部门工作人员对珊瑚礁生态系统进行定期的监测。由于全球变暖引起的珊瑚白化直接威胁珊瑚礁生态系统的生存和发展，其中与造礁石珊瑚共生的虫黄藻的种类和多样性直接影响到宿主石珊瑚能否抵御外界环境的变化，因此珊瑚礁保护区的常规监测不仅需要掌握造礁石珊瑚的群落种类变化，与其共生的虫黄藻的种类和多样性同样也需要监测，由于培养虫黄藻的技术不成熟以及不同生命周期的虫黄藻形态学特征不完全一致，以及虫黄藻因长期适应于共生关系的情形下常会失掉很多的外在特征，因此运用传统的形态学方法识别与造礁石珊瑚共生的虫黄藻的种类和多样性有其局限性。考虑到监测人员(包括科研人员和海洋保护管理部门工作人员)能够便捷及快速的进行监测，分子生物学技术的运用无疑是最恰当的手段。

利用分子生物学技术对虫黄藻进行种类鉴定首先要能提取到高质量的虫黄藻基因组DNA。由于虫黄藻共生于造礁石珊瑚体内，而造礁石珊瑚本身具有碳酸钙的骨骼，提取过程中碳酸钙盐会对基因组DNA片段造成机械剪切，从而为提取高质量的虫黄藻基因组DNA增加了困难。而常规的酚/氯仿提取方法，由于方法繁琐，并且具有有机溶剂的毒性，不适于常规检测的运用。因此需要研制一种简易的从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的方法，以满足珊瑚礁保护区常规监测任务的需要。

发明内容

本发明目的是提供一种能从造礁石珊瑚中快速、高效提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒及使用该试剂盒提取造礁石珊瑚共生虫黄藻基因组DNA的方法，用于解决珊瑚礁保护区常规监测中利用分子生物学技术识别与造礁石珊瑚共生的虫黄藻的种类和多样性的监测任务，为珊瑚礁保护区的保护和管理提供技术支持。

本发明所提供的虫黄藻DNA提取试剂盒，包含有以下试剂：

(a)试剂A：由pH8.0，100-300mM的Tris-Boric溶液、10-100mM的EDTA溶液、质量浓度1-5％的SDS溶液、50-200mM的NaCl溶液和蒸馏水按25∶10∶10∶2∶53的体积比混合而成；

(b)试剂B：为蛋白酶E，其浓度为5-15mg/ml；

(c)试剂C：为RNAase A，其浓度为5-30mg/ml；

(d)试剂D：为过饱和NaCl溶液，含有5-7M的NaCl；

(e)试剂E：为DNA洗涤液，为体积浓度为60-80％的乙醇溶液；

(f)试剂F：为DNA洗脱液，采用pH8.0，5-20mM的TE缓冲液。

本发明优选的试剂盒的配方如下：

(a)试剂A：由pH8.0，250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、质量浓度2％的SDS溶液、100mM的NaCl溶液和蒸馏水按25∶10∶10∶2∶53的体积比混合而成；

(b)试剂B：为蛋白酶E，其浓度为10mg/ml；

(c)试剂C：为RNAase A，其浓度为20mg/ml；

(d)试剂D：为过饱和NaCl溶液，含有7M的NaCl；

(e)试剂E：为DNA洗涤液，为体积浓度为75％的乙醇溶液；

(f)试剂F：为DNA洗脱液，采用pH8.0，10mM的TE缓冲液。

在本试剂盒里，试剂A在高温(55-65℃)下可裂解细胞，使蛋白变性、染色体离析。试剂B主要水解消化蛋白质。试剂C则用于降解RNA，防止RNA对下游操作造成干扰。试剂D为过饱和NaCl溶液，在高浓度NaCl低PH下，DNA可以与硅胶结合。试剂E用以清洗掉DNA以外的成分，在一定浓度的乙醇存在下，冲洗过程中，DNA不会溶失。试剂F提供低盐稳定PH环境，用以洗脱DNA。