[发明专利]提高转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因表达系统，具体涉及一种提高转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法。

背景技术

目前应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有两个，一个以苜蓿尺蠖夜蛾核型多角体病毒为载体，以秋粘虫细胞，菜青虫细胞或昆虫为宿主；另一为以家蚕核型多角体病毒为载体，以家蚕细胞或家蚕虫体及蛹体为表达宿主。两个表达系统都以各自病毒载体的多角体蛋白基因或P10基因或极早期基因IE-1等强启动子为外源基因表达的调控元件，通过将外源目的基因置于强启动子控制之下的重组病毒感染宿主细胞，有重组杆状病毒在宿主和细胞体内进行大量复制，在病毒感染宿主的晚期，外源基因的转录产物大量积累，在较短时间内得到高效表达。

与上述昆虫杆状病毒表达载体系统相比，利用转化细胞表达外源基因有其自身的优势：

(1)翻译后加工完善，天然活性高且稳定，可持续传代，生产效率高；

(2)通过转化细胞表达，整个过程中不涉及杆状病毒，生物安全性相对提高，并且，外源基因整合进细胞基因组，不会出现因病毒感染而影响细胞功能的现象，因此，表达产物能够得到更为有效的加工，如果借助无血清昆虫细胞培养技术和分泌表达技术，表达产物将非常容易纯化。

通常情况下，通过抗生素压力筛选可以获得稳定表达外源基因的转化细胞。运用G418筛选哺乳动物转化细胞已有较多的报道，但通过稳定转化的昆虫细胞表达外源基因的报道并不多见。Jarvis等用携带neo标记基因和ie-1(苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的极早期基因)启动子控制β-半乳糖苷酶基因表达盒的质粒转染sf-9细胞，通过G418压力筛选，获得转化sf-9细胞纯系，传代50次(约6个月)后的细胞仍保留整合的质粒序列，传代100次的细胞仍能表达同质的β-半乳糖苷酶，但表达水平较低，约为杆状病毒表达载体系统(BEVS)的1％(J Cell Biochem，1990，42：181-191)。

最近，Invitrogen公司开发了一种能在昆虫sf细胞稳定表达外源基因的载体pIZT/V5-His，该载体利用黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)核型多角体病毒的ie-2启动子控制外源基因，通过Zeocin的抗性标记筛选可获得稳定表达外源基因的细胞系。

鉴于利用转基因昆虫细胞表达外源基因具有的优越性，因此，独立研发提高稳定转化昆虫细胞表达外源基因的水平的方法具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种提高转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种提高转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法，包括以下具体步骤：

(1)构建昆虫细胞内具有活性的启动子X控制外源基因的载体；

(2)构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有报告基因的载体pigA3-en；

(3)双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进同样双酶切的pigA3-en，得带有增强子en和启动子X控制外源基因的载体；

(4)构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制新霉素抗性基因neo的重组载体；

(5)酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制新霉素抗性基因的片段Y-Neo，克隆进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有启动子X控制外源基因表达盒、增强子元件、启动子Y控制新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体；

(6)将步骤(5)所得重组转基因载体与表达转座酶的辅助质粒混合，转染昆虫细胞系，通过G418的分段筛选获得转基因昆虫细胞，其中G418的终浓度为800-2000μg/ml。

上述技术方案中，昆虫细胞内具有活性的启动子X和Y选自杆状病毒的极早期基因(ie-1)启动子、家蚕肌动蛋白(actin)A3启动子、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)的CMV启动子、昆虫热激蛋白(hsp)启动子中的一种，启动子X和启动子Y可以相同也可以不同；所述的增强子元件en选自家蚕丝素蛋白轻链基因第1内含子序列——fiben、杆状病毒的同源区——hr3en中的一种；报告基因可以为荧光蛋白基因；昆虫细胞可以是家蚕细胞或者其他昆虫组织建立的细胞系。

上述技术方案中所述辅助质粒的选择为该技术领域中常规的技术，该领域技术人员可以根据最后获得的具体转基因载体选择相应的辅助质粒。