[发明专利]共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法

说明书

1、技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说是一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合症的共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因的核酸疫苗，用于对猪提供针对猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫保护作用。

2、背景技术

猪繁殖与呼吸综合症可引起妊娠母猪流产、死产等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。自2006年6月初以来，在我国湖北、湖南、江西、安徽等十几个省份相继出现高致病性PRRSV为主要病原的猪“无名高热综合症”，给我国的养猪业造成了严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合症病毒为单股正链RNA病毒，长约15Kb。ORF5编码约25ku的糖蛋白GP5，能诱导机体产生中和抗体及特异性细胞免疫。ORF6编码M蛋白，该蛋白位于病毒囊膜内。M-GP5聚合物在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染中起重要作用。目前用于预防PRRS的弱毒苗和灭活苗已在我国广泛应用，但是猪繁殖与呼吸综合症仍未得到有效控制。核酸疫苗可将病毒保护性抗原的基因以质粒的方式导入动物体，其表达蛋白既可刺激产生体液免疫又可产生细胞免疫，本发明中将PRRSV ORF5及ORF6基因同时插入真核重组表达载体构建的核酸疫苗尚未见报道。

3、发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合症的共表达PRRSVORF5及ORF6双基因的核酸疫苗，使猪繁殖与呼吸综合症难以防治的现状得以突破。

本发明的目的是按以下方式实现的：

共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因的核酸疫苗，是在哺乳动物真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了PRRSV ORF5及ORF6完整基因，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6双基因核酸疫苗，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV的GP5及M蛋白。

上述核酸疫苗通过以下方法构建而成：

1)ORF5及ORF6的扩增

根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF5及ORF6的引物，引物序列如下：

P5s：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’

P5r：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’扩增702bp。

P6s：5’-AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3’

P6r：5’-AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3’扩增607bp。

以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增ORF6基因。

2)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的构建

将ORF6的PCR产物和pIRES质粒经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF6插入pIRES，构建pIRES-ORF6重组质粒；再将ORF5的PCR片段与pIRES-ORF6重组质粒经XbaI和NotI双酶切，将ORF5插入pIRES-ORF6，构建pIRES-ORF5及ORF6重组质粒。

3)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的转染

将pIRES-ORF5及ORF6转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系。通过RT-PCR检测ORF5及ORF6的转录情况，通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和免疫活性，通过间接免疫荧光试验进一步检测目的蛋白在细胞内的表达情况。上述试验均证明了目的基因的转录及目的蛋白的表达。

本发明的有益效果是：该核酸疫苗首次在哺乳动物细胞真核表达载体中插入了PRRSV ORF5及ORF6基因，突破了PRRSV常规灭活疫苗及弱毒疫苗的局限性，避免了弱毒疫苗使用后毒力返强情况的发生，弥补了灭活疫苗免疫后不能产生细胞免疫的缺陷，又可使针对GP5的抗体优先产生，改变了PRRSV感染后针对GP5的中和抗体产生慢而且产生量少的不足。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

4、附图说明

附图1是pIRES-ORF5及ORF6转染后细胞中GP5蛋白和M蛋白的SDS-PAGE

检测结果；

附图1标记说明：其中1)是蛋白质分子量标准；2)是pIRES-ORF5及ORF6转染细胞的上清；3)是pIRES转染细胞。

附图2pIRES-ORF5及ORF6转染细胞的间接免疫荧光检测结果。