[发明专利]用于生产重组纤溶酶原和纤溶酶多肽的方法

权利要求书

1.一种用于使重组纤溶酶原多肽重折叠的方法，其包括：

(a)使纤溶酶原多肽溶解于溶解缓冲液中，所述溶解缓冲液包含高浓度的离液剂、还原剂、氧化还原剂，并具有约9.0-约11.0的pH，从而产生溶解的纤溶酶原多肽溶液；和

(b)通过将所述溶解的纤溶酶原多肽溶液加入重折叠缓冲液中，用重折叠缓冲液快速稀释所述溶解的纤溶酶原多肽溶液，从而产生稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液，其中所述重折叠缓冲液包含精氨酸并具有约8.0-约10.0的pH；和

(c)温育所述稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液，从而产生重折叠的纤溶酶原多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述溶解缓冲液中的所述离液剂是尿素。

3.权利要求2的方法，其中所述尿素为约4M-约8M的浓度。

4.权利要求2的方法，其中在所述稀释的溶解的纤溶酶原多肽溶液中尿素是约0.1M-约2M浓度。

5.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液包含约0.05M-约0.5M精氨酸。

6.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液具有约9.0-约9.5的pH。

7.权利要求1的方法，其中在所述溶解缓冲液中所述还原剂是β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、或两者。

8.权利要求1的方法，其中所述氧化还原剂是氧化型和还原型谷胱甘肽。

9.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液还包含可逆的蛋白酶抑制剂。

10.权利要求1的方法，其中所述溶解缓冲液包含约100mM Tris、约8M尿素、约1mM甘氨酸、约1mM EDTA、约10mM β-巯基乙醇、约10mM DTT、约1mM还原型谷胱甘肽(GSH)和约0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH约9.5-约10.5。

11.权利要求10的方法，其中所述重折叠缓冲液包含约20mM Tris、约0.2M精氨酸，pH约9.0至约9.5。

12.权利要求11的方法，其中在所述溶解的纤溶酶原多肽溶液中所述蛋白质的浓度在稀释前被调整至约2mg/ml。

13.权利要求12的方法，其中将所述溶解的纤溶酶原多肽稀释到约20倍重折叠缓冲液中。

14.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原多肽从细菌包含体中溶解。

15.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基561-810。

16.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

17.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

18.权利要求1的方法，其还包括纯化所述重折叠的纤溶酶原多肽。

19.权利要求1的方法，其中所述重折叠的纤溶酶原多肽通过尺寸排阻层析(SEC)进行纯化。

20.权利要求1的方法，其中所述重折叠的纤溶酶原多肽通过离子交换层析(IEC)进行纯化。

21.权利要求1的方法，其中所述重折叠的纤溶酶原多肽通过苯甲脒亲和层析进行纯化。

22.权利要求18的方法，其还包括通过纤溶酶原激活物处理纯化的重折叠的纤溶酶原多肽，以产生生物学活性的纤溶酶多肽。

23.权利要求22的方法，其中所述纤溶酶原多肽从细菌包含体中溶解。

24.一种组合物，其包含通过权利要求23的方法生产的纤溶酶多肽。

25.权利要求24的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。