[发明专利]玉米微RNA序列

说明书

本申请要求于2006年10月5日提交的第60/849,672号美国临时申请的优先权，该临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明的领域一般涉及植物分子生物学。更具体地讲，本发明涉及用于抑制靶基因表达的构建体和方法。

发明背景

微RNA(miRNA)仅仅在几年前被首次鉴定出来，但是已清楚的是，他们在调节基因活性中起重要作用。这些20-22核苷酸非编码RNA能够经由碱基配对与特异性靶mRNA杂交，并且通过介导RNA裂解或翻译阻抑来下调这些转录物的表达。最近的研究已经表明，miRNA在发育期间具有重要功能。在植物中，已经表明他们控制多个发育过程，包括开花时间、叶子形态学、器官极性、花形态学以及根发育(综述于Mallory和Vaucheret(2006)Nat Genet 38：S31-36中)。由于miRNA的确定的调节作用，它们有可能还参与某些主要作物特征例如抗旱性和抗病性。

植物miRNA是从长度为50至500个核苷酸、称为pre-miRNA的较长前体转录物加工的，并且这些前体能够形成稳定的发夹结构(综述于Bartel(2004)Cell 116：281-297中)。很多miRNA发夹前体最初是作为1-2kb或更长的较长转录物存在，其称为pri-miRNA，是聚腺苷酸化的和加冒的。该事实与在表达序列标记(EST)文库中检测到很多pri-miRNA结合在一起表明，RNA聚合酶II是负责miRNA基因转录的酶。转基因实验表明，是pre-miRNA的结构而不是其序列指导它们的正确加工，并且对于miRNA的生成来说，不需要其余pri-miRNA。虽然在后生动物中，pri-miRNA在细胞核中通过Drosha被加工成pre-miRNA，并且在细胞质中Dicer裂解pre-miRNA，但是植物中的miRNA成熟与动物中的途径不同，因为植物缺乏Drosha同系物。反而，除了其在发夹加工中的已知功能以外，与Dicer同源的RNase III酶DICER-LIKE 1(DCL1)还可具有Drosha功能(Kurihara和Watanabe(2004)Proc Natl Acad Sci 101：12753-12758)。

通过几个实验室的克隆努力，已经在拟南芥(Arabidopsis)中鉴定出了至少30个miRNA家族(综述于Meyers等人，(2006)Curr Opin Biotech17；1-8中)。很多这些miRNA序列由一个以上基因座表现，总数目最高达大约100个。因为由一个实验室发现的特定miRNA与另一个实验室发现的miRNA一般不重叠，所以假定对于由给定植物基因组表达的整组miRNA-“miRNome”的探求仍然是不完整的。导致这种情况的一个原因可能是，很多miRNA仅在非常特定的条件下表达，并且由此被标准克隆工作所遗漏。Sunkar和Zhu的最近研究(2004，Plant Cell 16：2001-2019)提出，实际上，可通过给文库构建选择“非标准”生长条件来帮助miRNA发现。Sunkar和Zhu在由多种不同胁迫诱导的组织组成的文库中鉴定了新的miRNA。他们继续进行研究，以证实干旱、寒冷和其他胁迫对这些miRNA当中的某一些的诱导，这意味着在miRNA在应激反应中的作用。完全表征植物miRNome的努力可能需要在很多不同组织中以及在很多不同条件下测定小的RNA状况。

标准miRNA克隆的一个补充方法是使用可获得的基因组和/或EST序列计算预测miRNA，并且已经有几个实验室报道了使用该方法发现了新的拟南芥miRNA(综述于Bonnet等人，(2006)New Phytol171：451-468)。使用部分依赖于观察到已知miRNA位于发夹前体中的这些计算方法，已经预测了几百种植物miRNA。然而，只有一小部分已经通过Northern印记分析得到实验证实。此外，这些计算方法中的大部分依赖于比较两个典型基因组(例如拟南芥和水稻)，以发现保守基因间隔区，因此不适于鉴定物种特异性miRNA，所述物种特异性miRNA可能代表任何给定生物体的miRNome的相当大的一部分。