[发明专利]家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用

说明书

技术领域：本发明涉及一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，属于昆虫抗菌肽的分离纯化技术领域。

背景技术：昆虫每天都会直接接触、食入、吸入成千上万的病原微生物而不至于患感染性疾病，这种抵抗外来致病微生物的能力主要是通过天然免疫的防御机制得以实现。抗菌肽是所有物种中天然防御机制的重要组成部分，这类多肽可以是固有表达的，也可以被病原微生物及其产物诱导表达。

昆虫抗菌肽是一类分子量小、水溶性好、稳定、抗菌谱广且抗菌机制独特的多肽，是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的物质。不少科学家认为，昆虫具有惊人的天然免疫力，并以抗菌肽作为其宿主防御机制的主要成分。抗菌肽除有非特异性的抗病原微生物外，还有抗肿瘤细胞的作用，而对人体的正常细胞无破坏作用。因此，抗菌肽的开发和利用是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。

家蝇是重要的医学昆虫，能够机械传播人、畜多种病原菌如细菌、病毒和寄生虫卵等。目前国内外报道已从其幼虫血淋巴中分离到了多种抗细菌、真菌、原虫的生物活性抗菌蛋白/多肽，在幼虫体外分泌物中发现了广谱的抗植物病原菌、植物根结线虫及寄生虫卵的物质。但这些研究多集中于抗菌肽的诱导及活性检测阶段，而体外不同环境对其抗菌活性的影响均无报道。目前，抗菌肽的纯化方法多使用性质温和的凝胶层析，但该方法所需时间较长，每次上样量及目的蛋白的回收量较小。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用。本发明采用透析、固相萃取、超滤和反相高效液相色谱方法从家蝇幼虫分泌物中分离到具广谱抗菌活性的肽类物质，使抗菌肽制备时间缩短，提高了分离纯化的效率，而且该抗菌肽在体外不同的环境中其抗菌活性具有较强的稳定性，可通过破坏细菌细胞膜通透性、抑制细菌体分裂、阻碍与细胞分裂相关的某些蛋白质的合成等途径发挥抗菌作用；具有提高特异性和非特异性免疫功能的作用，对细菌感染有一定的保护作用。

本发明是这样实现的：家蝇分泌型抗菌肽的分离方法为：将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。

所述的抗菌肽粗提液，即家蝇幼虫外分泌物粗提液的制备为：取三龄家蝇幼虫置于干净大烧杯中，充分清洁体表后浸于适量蒸馏水中4小时，不时振摇；吸取浸液离心10000g×10min，上清液冷冻干燥浓缩，即得抗菌肽粗提液，4℃保存备用。

具体的分离方法为：(1)透析：将浓缩的抗菌肽粗提液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析过夜，其间换掉外液两次；取内液用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用；(2)固相萃取：取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C₁₈ Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脱，流速为1ml/min；各洗脱组分冷冻干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超纯水溶解，检测该洗脱组分的抗菌活性；收集、浓缩、冻干具有活性的组分，超纯水溶解，12000rpm离心10min，收集上清液-20℃保存备用；(3)超滤：将固相萃取活性组分合并后加到截留分子量为3KD的超滤管中，5000×g离心30min分离；继续将未透过超滤管的组分加到截留分子量为30KD的超滤管中，同上离心，分别收集超滤管中和管下液体，将活性物质分为三个部分：分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各组分检测蛋白浓度和抗菌活性；(4)反相高效液相色谱纯化：超滤后活性组分用0.22μm微孔滤膜过滤，100μl上C₁₈反相色谱柱，流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B：0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色谱柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脱条件为：梯度洗脱，30min内己腈浓度从5％上升到60％流速1ml/min，手工收集214nm波长洗脱峰，即获得两个抗菌肽组分。

以上所用的Sep-pak C₁₈ Cartridge固相萃取小柱在加样前预用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C₁₈反相色谱柱为Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。

上述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法分离得到的家蝇分泌型抗菌肽。

上述家蝇分泌型抗菌肽在制备提高特异性或非特异性免疫功能、抗细菌感染的药物或保健品中的应用。