[发明专利]一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

白细胞介素15(Interleukin 15，IL-15)是一种与炎症及自身免疫病密切相关的细胞因子。完整的IL-15受体(IL-15 receptor，IL-15R)是由α、β和γ三条链组成的异源三聚体(IL-15Rαβγ)。其中α链(IL-15Rα)是形成高特异、高亲和力IL-15R的必要亚单位。

IL-15Rα是一种I型跨膜蛋白，其基因分别定位于人的第10号染色体和鼠的第2号染色体上。全长IL-15Rα由263氨基酸残基(amino acid，aa)组成，其中包括32aa的信号肽，173aa的胞外段，21aa的跨膜段以及37aa的胞内段。在没有β和γ链参与的情况下，IL-15Rα便可与IL-15高亲和力结合(Kd＝10^-11mol/L)，该亲和力的大小和IL-15Rαβγ与IL-15之间的亲和力处于同一数量级。参与受体复合物组成的单一亚单位具有与完整受体复合物相当的、与相应配体结合的能力，这一不同寻常的特性使IL-15Rα成为近年来免疫学研究的热门分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法，我们对鼠IL-15Rα的胞外段，即可溶性IL-15Rα(soluble IL-15Rα，sIL-15Rα)进行了基因克隆、原核表达及初步的生物学活性测定，以期为后续深入研究创造条件。

本发明的技术方案：一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法，步骤为：

(1)引物设计：根据已知的GenBank中鼠IL-15Rα的cDNA序列，设计针对sIL-15Rα编码序列的引物对，在上游引物P1的5′端引入BamH I酶切位点，在下游引物P2的5′端引入Sal I酶切位点，酶切位点用下划线标示，引物序列如下：

P1，5′-GTAGGATCCGTCACCACGTGACCACCTC-3′；

P2，5′-GATGTCGACTATCGTCATTCTCGAACTG-3′；

(2)sIL-15Rα基因克隆及重组表达质粒pQE-30/sIL-15Rα的构建：将体外培养的小鼠脾脏细胞用100U/mL干扰素-γ刺激24h，Trizol法提取细胞总RNA，以Oligo T为引物合成cDNA第一链，并以此为模板，用P1和P2进行PCR扩增；PCR条件为：94℃5分钟；94℃ 15秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环；72℃ 5分钟；PCR产物经电泳分离、割胶回收后，与pMD18-T simple载体连接，得pMD18-T/sIL-15Rα重组质粒，并转化至TG1感受态细菌，经测序确证的重组质粒pMD18-T/sIL-15Rα经BamH I和Sal I双酶切，所释放的sIL-15Rα基因片段与经同样双酶切的表达载体pQE-30连接，获pQE-30/sIL-15Rα重组表达质粒，并转化至M15感受态细菌，命名为pQE-30/sIL-15Rα/M15；于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的固体LB培养基上挑取单个菌落，用PCR和酶切鉴定；

(3)sIL-15Rα的诱导表达：挑取经鉴定确证的单菌落，接种于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日，按1∶100比例接种于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养至A600值达0.5～0.8，加异丙基-β-D-硫代半乳糖至终浓度为1.0mmol/L，继续振荡培养，于诱导1h、3h及5h后分别收集菌液，加等体积SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取10μL进行SDS-PAGE和Western blot分析，以转空载体pQE-30的M15菌作为对照；