[发明专利]基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种纳米技术领域方法，特别是一种基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温(95℃)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温(37～55℃)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度(72℃)下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2ⁿ的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增10⁹倍以上。短短几十年，PCR技术因其特异性高、灵敏度高、简单快速、对样本的纯度要求低、可定量模板数等优点，在生物科学众多领域的应用日趋广泛。尽管PCR技术已经日益成为一个成熟的技术，但实际操作中，进行PCR扩增仍旧存在需改进的问题，如特异性、灵敏度、反应速度等问题。最突出的问题就是PCR扩增存在不同程度的非特异性。PCR作为一种体外模拟的DNA链式扩增反应，机制非常复杂，在链式反应过程中总是会发生一定程度的干扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。科学家们从不同的角度来尝试解决这个问题，如从模板、引物、Mg²⁺浓度、退火温度等角度改善其特异性，或将增效剂如甲酰胺、甘油、二甲基亚砜，甜菜碱、氯化四甲基铵等引入PCR体系。但在实际应用中，效果却不尽如人意，甚至会抑制PCR的扩增过程。

经对现有技术文献的检索发现，美国专利US PATENT 5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB)，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，商品化试剂盒非常昂贵，价格是常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮存于-20℃，并且其生物活性保持期限较短。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应优化方法，使其在明显增高成本的情况下，提高PCR反应的扩增特异性和目标DNA的产量。本发明通过将有效量的纳米二氧化钛(TiO₂)材料添加到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应，达到增加PCR反应的特异性，提高PCR目标产物的产量的效果；同时，由于纳米二氧化钛材料制备简便，成本低廉，易于保存，且优化材料易于从体系中分离，相比于其他生物分子添加材料SSB等成本大大降低。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在聚合酶链式反应体系里加入纳米二氧化钛材料作为添加剂优化聚合酶链式反应。所述纳米二氧化钛材料，在制备聚合酶链式反应体系过程中加入。所述纳米二氧化钛材料的粒径在1nm～200nm之间均可用于作为PCR的优化材料。

所述纳米二氧化钛材料为胶体溶液，可以采用现有技术制备1nm～200nm的样品；也可以直接购买商业化产品，如Sigma公司可提供25nm-100nm的纳米二氧化钛材料。

在实际应用中，将有效量的纳米二氧化钛材料作为添加剂加入到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应。所述有效量是指产生优化作用的有效用量范围。针对纳米二氧化钛材料的粒径不同，聚合酶链式反应体系不同，产生优化作用的所需添加的纳米二氧化钛有效用量范围是不同的。

针对不同聚合酶链式反应体系，不同粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料有效用量范围通过以下方法进行确定：通过对该特定粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该纳米二氧化钛材料的有效用量范围。