[发明专利]一种分离鉴定血液中有核红细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液分离鉴定检测技术领域，特别涉及一种分离鉴定血液中有核红细胞的方法。

背景技术

血样品分离成为各种细胞组分，就需要相应地调节血样的处理/加工技术。将全血样品分离成为其各种细胞组分的常规方法是用离心的方法。虽然此种方法是有效的，但是需要花很大的劳动、效率相当低而且需要用人工来控制血样中的细胞部分。

有核红细胞的分离，是基因分析的开端，也是较为困难的步骤之一。现如今各国学者们已经尝试了各种不同的方法来分离有核红细胞，但仍未找到直接、可靠、高效率的分离途径。

在试图用化学药剂来进行血样中的细胞部分的此种分离时，由于种种原因，结果始终是不能令人完全满意的。更准确地说，细胞种群在活体内或体外的生活强度和生存性，均取决于保持一种与保存实际细胞结构和细胞中的化学平衡一致的准确生理环境。细胞膜的渗透性和运送特性可控制细胞中的化学平衡。生理环境的改变又可以诱发细胞膜的应答或改变。细胞膜应答在性质上是“防御性的”；也就是说，细胞膜的生理应答是适合于保持细胞中的化学平衡，因此是延续和不间断细胞的生存性现在已充分认识到，细胞只能在一定的限度范围内耐受此种理想生理环境的改变；而且，还认识到如果超过此种限度，细胞就会遭到永久性的损伤。在本技术领域中还进一步认识到，此种生理环境的改变(即，稀释介质的毒性-即使是用蒸馏水)可影响细胞的溶血作用。

目前获取有核红细胞的途径主要有两条：①直接获取。利用有核红细胞表面抗原如CD71，GPA，CD36等作为标记，通过磁激活细胞分选法(magneticactivated sorting，MACS)或荧光激活细胞分选法(fluorescenceactivated cellsorting，FACS)技术获取有核红细胞，或利用血液中Y珠蛋白链作为标记，通过免疫组织化学等方法直接识别后，显微操作获取。②间接获取。以显微操作法最具代表性，先染色，从形态上识别，借助高倍显微操作捕获单个有核红细胞，再应用于基因分析。直接获取法成本高，或特异性不强，易受污染，或操作繁琐，技术要求高，其可靠性、实用性受到置疑，难以推广应用。间接获取法可有效避免污染，随着单细胞PCR技术的发展，该法被视为获取有核红细胞较理想的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：建立一种快速有效的分离鉴定血液中有核红细胞的方法，便于显微操作，能够高效、准确地获取有核红细胞进行后续的细胞鉴定及基因分析。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种分离鉴定血液中有核红细胞的方法，包括以下步骤：

(一)配制试剂

(1)多聚赖氨酸工作液：多聚赖氨酸储备液与双蒸水1∶10充分混合，气泡消失后备用；

(2)PH7.4含0.5％BSA的0.01mol/L PBS：

氯化钠            6.5g

Na₂HPO₄·12H₂O    4g

NaH₂PO₄·2H₂O     0.35g

加双蒸水800ml，调节PH值至7.4，双蒸水补至1000ml，0.01mol/L PBS，高压灭菌后，加入5g BSA，40℃保存；

(3)含KOH 200mmol/L，DTT 50mmol/L的碱性细胞裂解液：

400mmol/L KOH  1ml

1mol/L DTT     100ul

灭菌注射用水850ul，充分混合，0.22μm微孔过滤器过滤后分装，-20℃保存备用；

(二)制备防脱胶玻片

(1)载玻片的预处理

将普通载玻片用热肥皂水洗刷，自来水清洁干净，烘干，置于硫酸清洁液中浸泡24小时以上，自来水冲洗过夜，双蒸水冲洗3遍，烘干，95％乙醇浸泡24小时，双蒸水冲洗3遍，烤干，15磅高压灭菌20min；

(2)多聚赖氨酸包被载玻片

将预处理后的玻片在多聚赖氨酸工作液中上下浸蘸10～20秒，分散架于玻片架上，60℃以下烘干，4℃保存备用；

(三)选择有核红细胞染色方法；

(四)显微操作法获取血液中有核红细胞。

所述步骤(三)可以进一步包括以下步骤：

单密度梯度离心法收集有核血细胞：