[发明专利]用于提高斑贝链霉菌黄霉素产量的方法及菌株

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物分子育种领域，具体涉及大肠杆菌-斑贝链霉菌接合转移系统的优化，高产斑贝链霉菌菌株的选育，中间载体的构建和利用筛选得到的斑贝链霉菌菌株提高黄霉素产量的方法。本发明利用基因工程手段破坏一个基因来达到提高斑贝链霉菌产生黄霉素水平的方法，该基因为nsdA基因的同源基因，nsdA基因在天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)中是一个抗生素产生的负调节基因。本发明建立在斑贝链霉菌中将nsdA同源基因破坏，利用改造的菌株提高黄霉素的产量。 

背景技术

链霉菌属于一类极具商业价值的工业微生物。自然界中有近70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的，它们分别在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等方面具有功效。例如用于抗家畜寄生虫和杀螨虫的阿维菌素，防治水稻纹枯病的井岗霉素，用于医疗和和兽药的红霉素、泰乐菌素、金霉素，用于动物生长促进剂的黄霉素，用于植物保护的春日霉素、多氧霉素、庆大霉素，用于抗肿瘤的柔毛霉素，用于免疫抑制剂的FK506和雷帕霉素等。 

由于链霉菌具有如此大的商业价值，人们想出了很多方法来提高链霉菌的抗生素产量，这些方法主要包括两大类：一类是通过物理化学的方法对链霉菌进行诱变，然后在诱变后代中筛选高产菌株，这类方法具有很大的盲目性，筛选工作量很大；另一类就是通过遗传学方法对菌株进行直接的改造，如原生质体融合再生法，基因工程手段来提高抗生素产量。随着分子生物学技术的不断发展，链霉菌基因组研究的不断深入，人们对链霉菌基因功能认识在不断深化，通过基因工程手段对菌株进行改造已经成为可能。 

对链霉菌进行遗传操作，首先要建立方便快捷的操作方法，其中原生质体转化和大肠杆菌-链霉菌属间接合转移是两种最常用的方法。原生质体转化法由于步骤复杂，原生质体再生容易发生突变及再生困难等难题已经逐渐被接合转移法所代替。接合转移方法受体链霉菌状态分为两种，一种是孢子热激法，另一种是菌丝体法。对于接合转移，受体菌状态是影响因素之一，另一种就是接合转移用的培养基。合适的培养基可以显著提高接合转移效率。 

通过基因工程手段对链霉菌进行改造，提高抗生素的产量，主要是通过改造抗生素产生的调节基因和关键限速酶基因来实现的。这些调节基因，有的是起正调节作用的，有的是起负调节作用的，有的是多效性的，有的是专一性的。对于正调节基因，可以通过增加基因剂量的方法实现抗生素的增产；对于负调节基因，则可通过破坏该基因来提高抗生素的产量。而破坏负调节基因的方法主要是通过基因中断或置换来实现的。其基本原理是基于染色体的 同源重组，即用作基因置换的质粒上携带有两个长度合适而且天然方向一致的染色体片段，片段之间插入能在链霉菌中表达的抗性标记(如安普霉素)，同时载体部分也含有在链霉菌中表达的抗性标记(如卡那霉素和硫链丝菌素)。基因置换是在抗生素的选择压力下，以单拷贝或低拷贝的形式发生的，因此质粒在受体菌中一般是不复制的。质粒通常采用的形式有几种，如只在大肠杆菌中复制的单功能载体，温敏型质粒或复制及稳定功能有缺陷的质粒。当质粒转入受体菌时，可通过单抗或双抗筛选获得发生单交换的转化子，质粒这时通过与染色体上同源片段之间的重组而整合到染色体上。将上述转化子在松弛条件下生长一代或几代，可大大提高二次交换发生的频率，然后通过影印或者点种在两种不同抗生素平板上，挑取只对插入抗性标记敏感的转化子即可能为发生基因置换的菌株。 

nsdA基因(negative regulator of Streptomyces differentiation)是一个首先在天蓝色链霉菌中发现的全局性负调控基因，对天蓝色链霉菌的产孢、形态分化与抗生素的合成均有负调控作用。后来又相继在多种链霉菌中发现了nsdA同源基因的存在。目前文献中，还没有利用该基因来提高斑贝链霉菌黄霉素产量的报道。 

本发明的工作是黄霉素生产菌株斑贝链霉菌ZM2006中进行的。对于黄霉素生物合成基因簇的研究现在还是空白，但是通过nsdA通用引物PCR扩增斑贝链霉菌基因组DNA，发现在斑贝链霉菌染色体上存在nsdA的同源基因。 

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程手段来提高斑贝链霉菌黄霉素产量，该方法是分子生物学方法的一种，通过破坏斑贝链霉菌染色体上的nsdA同源基因，达到提高黄霉素产量的目的。 

本发明进一步提供了对斑贝链霉菌进行遗传操作的培养基，通过该培养基可以快速对斑贝链霉菌进行遗传操作。