[发明专利]一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法

权利要求书

1.一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，其特征是以明胶、海藻酸钠和/或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；或以尼龙网为载体采用先交联后共价结合的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；

(A)包埋-交联法：以明胶、海藻酸钠和/或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶：

a)配制pH4-10的质量浓度5％-27％的20g胶溶液，在30℃水浴中使胶完全溶解；

b)按照活力比2∶1-1∶5将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于2mL去离子水中；

c)将b)配制的乳糖酶和葡萄糖异构酶的混合酶液添加到胶溶液中，使两种酶的添加量为1-30U/g胶溶液，搅拌混匀；

d)在c)所得的胶溶液中加入2mL体积分数0.05％-5％的戊二醛，搅拌后立即倒入培养皿中，4℃硬化过夜，得凝胶；

e)次日将凝胶浸入到体积分数0.05％-5％的戊二醛中，在4℃-30℃交联10min-60min，然后用去离子水清洗凝胶若干次，滤纸吸干表面水，最后切成2mm见方的小方块，即为共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；

或(B)交联-共价法：采用尼龙网为载体共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶：

a)尼龙网的预处理：将60目的尼龙网裁成边长2cm的小片，先用1mol/LNaOH浸洗10min，水洗至中性，再用1mol/L HCl浸洗10min，再水洗至中性，然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性杂质，再用乙醇除去丙酮，晾干，接着将尼龙网浸泡在含18.6％CaCl₂和18.6％水的甲醇溶液中，50℃保温20min，将尼龙网滤出并彻底水洗，乙醇脱水，晾干；

b)尼龙网的活化：将预处理后的尼龙网浸入到3-二甲氨基丙胺中70℃活化5-15h，彻底水洗；

c)载体的交联：将活化后的尼龙网浸入体积分数0.05％-5％、pH4-10的戊二醛中，4℃-30℃浸泡10min-60min，接着用pH 7的磷酸盐缓冲液反复清洗尼龙网；

d)酶与载体的结合：配制浓度为1-30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL酶液-30g/100mL酶液的量将尼龙网添加到乳糖酶液中，4℃-30℃下不断搅拌浸泡5-20h，滤出尼龙网，水洗至水洗液中无蛋白之后再将尼龙网浸泡到1-30U/mL的葡萄糖异构酶溶液中，尼龙网的添加量为100mL酶液用5-30g尼龙网，4℃-30℃不停缓慢搅拌浸泡5-20h，最后用去离子水多次清洗尼龙网表面至水洗液中无蛋白，用冷风吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。

2.根据权利要求1所述的一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，其特征是所用的游离乳糖酶的比活力为3000U/g，游离葡萄糖异构酶的比活力为2000U/g。

3.用权利要求1所述方法构建的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的应用，其特征是将共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶用于以乳糖为底物制备乳果糖。