[发明专利]动物关节软骨组织总RNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种富含蛋白多糖的RNA提取方法，特别涉及一种动物关节软骨组织总RNA提取方法。

背景技术

各种关节疾病和脊柱关节的疾病的治疗一直是医学界面临的难题，国内外正在开始尝试的基因治疗有望获得该领域治疗的突破。从基因水平对软骨组织进行研究意义重大，而从软骨组织中提取高质量的RNA是各种基因表达研究的基础。

关节软骨基质多，细胞少，细胞成分只占20％，软骨基质的主要成分是II型胶原，由于II型胶原中富含羟赖氨酸，并且羟赖氨酸的羟基几乎全部和糖结合，因而糖化率高，含糖量约为10％，因此软骨基质主要成分是蛋白多糖。关节软骨属于细胞含量少的组织，组织RNA含量低，并且多糖的理化性质与核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA时，蛋白多糖和RNA一块无区分的沉淀下来，产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，这样的RNA由于蛋白多糖的干扰无法进行后续的各种分子生物学试验。在去除多糖的同时RNA也被带走，造成RNA的大量丢失，因此从软骨中提取高质、足量的RNA非常困难。

由于软骨组织的特殊结构，目前尚无有效的方法来解决这一难题，基于酸酚/胍盐原理的总RNA抽提方法是动物组织、细胞核酸分离的主要方法，如一步法、trizol法等，但基于酸酚/胍盐原理的方法不适于富含多糖的动物组织，因为该种方法不能区分理化性质相似的多聚核糖和蛋白多糖，在进行RNA沉淀的时候，蛋白多糖和RNA一起沉淀下来，而去除蛋白多糖的步骤也是RNA损失的步骤。plant RNAout法是基于CTAB裂解法的总RNA提取方法，其优点是操作简便、易行，含CTAB的裂解液是用于富含多糖和多酚的植物总RNA抽提的首选细胞裂解方法，可以有效的分离植物组织中的多糖和RNA，但通过多次实验证明，该方法用于抽提新西兰白兔关节软骨组织的总RNA时引入DAN污染。因此，我们试验证明用一步法、trizol法、anima RNAout法、植物RNA提取法等成熟的RNA提取方法都不能获得高质量总RNA，采用经典的去除多糖的方法如高盐、低醇沉淀法都不能去除大量的多糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，它适用于含蛋白多糖的RNA难提组织的小量总RNA提取，采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，并且质量好、纯度高、完整性好，可以满足分子生物学研究应用。

本发明方法有以下步骤：

(1)取动物关节软骨组织，立即投入液氮中研磨至粉末状，每50重量份的关节软骨组织加入1体积变性液，0.007体积的β-巯基乙醇，匀浆至无明显组织块；

(2)将匀浆液置于冰水浴上，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，置于冰水浴上15min；

(3)4℃下，离心，取上清液，加入氯仿、异戊醇混合液，离心取上清加入异丙醇，-20℃下沉淀30min，离心30分钟，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入无RNA酶水，溶解沉淀得到胶状溶液；

(4)取胶状溶液用plant RNAout试剂盒的RNA提取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤二次后用无RNA酶水溶解沉淀即得关节软骨组织总RNA溶液。

本发明所述的重量与体积的计量单位，采用克与毫升或千克与升或微克与微升等。

通常细胞中约75％的RNA酶存在于胞液中，当细胞裂解后，RNA酶会释放出来，在没有有效的抑制措施下，RNA酶会迅速降解RNA。一步法所用的裂解液主要成分为异硫氰酸胍，它是一种强烈的蛋白质变性剂，能有效的抑制RNase活性，使RNase变性，裂解液中加入的β-巯基乙醇也是RNase的强烈抑制剂，联合应用可有效防止RNA降解。