[发明专利]家蚕先天免疫信号途径中的bmimd基因

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及来自家蚕先天免疫信号传递途径中的一个关键基因bmimd基因。

背景技术

免疫机制的研究是一个漫长而困难的过程。现代分子生物学及遗传学等先进技术为研究提供了有力的工具。昆虫受到不同的微生物感染时，能诱导不同的抗菌肽基因表达，而这些抗菌肽基因的表达主要受两种信号转导途径的调控，即Toll途径和Imd途径。这两种途径通过激活不同的转录因子来调控不同的抗菌肽基因表达。Imd(immune deficiency)，最初发现该基因的突变会引起果蝇对革兰氏阴性菌失去抵抗能力，是目前所知能改变编码抗菌肽基因、具有被微生物诱导性的第一个突变。Imd途径就是以该基因命名的，是该信号途径中的关键基因。

经过研究，果蝇imd基因编码一个30kd的蛋白，含有一个致死结构域，该结构域与哺乳动物RIP(TNF-受体相互作用蛋白)极其相似。Imd蛋白包含一个80-aa的c-末端致死结构域和一个173-aa的N-末端区域，后者与其它蛋白没有多大的同源性。C-末端部分包含一个致死结构域，并能与其它致死结构域蛋白如FADD相互作用，FADD是在下游信号传递中所需要的，并且也是受体复合物的一部分。

致死结构域蛋白Imd作用于遗传学定义的细胞内信号级联反应最顶部，位于跨膜蛋白PGRP-LC的下游，该级联反应激活Relish转录因子。通过实验证明，PGRP-LC与Imd能形成复合物。果蝇Imd和PGRP-LC突变体在抗菌肽的反应方面具有非常相似的作用。Imd突变体和PGRP-LC突变体在没有血细胞的时候也能对脓病毒引起的创伤做出反应。Imd也在表皮发挥作用，允许在本地对脓病毒形成的创伤做出应答。Philippe Georgel等人进一步研究还发现imd基因控制Diptericin(双翅肽)、Drosocin(果蝇肽)、Cecropins(天蚕素)、Attacins(樗蚕素)等抗菌肽的分泌表达。

果蝇imd突变体的发现，为研究该基因的功能提供了便利。虽然该基因在果蝇中的研究较深入，但在其它物种中几乎未见报道。

发明内容

本发明申请人将比较基因组学研究与基因功能研究相结合，其目的在于提供一种家蚕imd基因，进一步研究确定bmimd基因在家蚕体液免疫信号传递途径中行使的功能：是否能与家蚕跨膜蛋白PGRP-LC形成复合物、能否控制抗菌肽的表达、具体控制了哪些抗菌肽的表达和该基因的突变对家蚕抗微生物侵染有何影响，进而寻找在家蚕中是否具有该基因的突变体存在。bmimd基因在免疫信号传递途径中功能的确立，在理论上将为鳞翅目昆虫的先天免疫应答机制的阐述提供数据支撑，在产业上将为家蚕抗性的品系的鉴定研究提供参考。

本发明申请人通过对家蚕imd基因进行生物信息学研究、获得了bmimd基因的全长cDNA序列，进而对该基因进行克隆、体外表达及表达蛋白纯化、抗体制备和基因干涉等。具体方法如下：

(1)生物信息学研究：从美国国立生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载果蝇imd基因的序列；该序列与家蚕EST数据库进行BLASTN检索，挑选比对较好序列，用DNAstar软件进行序列拼接延伸，经迭代检索到不能延伸为止，最后得到一条长度为1092bp的重叠群；预测基因的外显子、内含子结构采用sim4程序(http://gamay.univ2perp.fr/analyse seq/sim4)；预测结构域采用SMART软件(http://smart.embl2heidelberg.de/)；预测分子量、等电点采用Expasy网站(http://ca.expasy.org/tools/)；

(2)Bmimd的克隆及测序验证：用Trizol提取RNA，M-MLV反转录为cDNA；用引物F5’gccggatccGGCCACTTTAAAAACAAAG 3’(BamH I酶切位点)和R5’cgcctcgagTTAGTTTTTTTCAGAGTAC 3’(XhoI酶切位点)PCR扩增、回收，连接目的片段到PMD18-T载体；挑选阳性克隆经酶切验证后送到上海生物工程公司测序；该克隆命名为imd/PMD18-T；