[发明专利]超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂及其制备

权利要求书

1.一种超顺磁性氧化铁标记的反寡核苷酸探针对比剂，包括由超顺磁性的四氧化三铁纳米颗粒外包葡聚糖构成载体及c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段，所述反义寡核苷酸与所述载体中的葡聚糖以共价键连接。

2.根据权利要求1所述的超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，其特征在于：所述c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的核苷酸序列为：CTCCATGGTGCTCAC。

3.根据权利要求1所述的超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，其特征在于：所述载体的粒径为20～35nm，对比剂的粒径为25～40nm。

4.根据权利要求1所述的超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，其特征在于：所述载体中，纯化后超顺磁性氧化铁与葡聚糖的重量份数比为1∶3～8；对比剂中，纯化后载体与c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸的质量比为6～10∶1。

5.根据权利要求1所述的超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，其特征在于：对比剂的磁学参数为：T₂弛豫率为(0.156～0.163)×10⁶mol^-1.sec^-1，饱和磁化强度为69-71emu/gFe，比饱和磁化强度68-70emu/g，比剩余磁化强度为25-31emu/g，剩磁为15-20Gs。

6.根据权利要求1所述的超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，其特征在于：所述葡聚糖类型为葡聚糖T-10或葡聚糖T-40。

7.一种制备如权利要求1所述对比剂的方法：包括如下的步骤：

(1).载体的制备：采用共沉淀一步法完成，合成四氧化三铁的反应原理为：Fe²⁺2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O；在合成四氧化三铁的同时加入葡聚糖，获得所述外包葡聚糖的四氧化三铁载体；

(2).对寡核苷酸序列为CTCCATGGTGCTCAC的c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的合成；

(3).对比剂的合成：具体步骤为：纯化步骤(1)获得的外包葡聚糖的四氧化三铁载体：取所述载体过柱后；加入相当于载体1/5的氧化剂0.1M高碘酸钠，使载体中的葡聚糖的羟基氧化为醛基，能与c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的氨基反应形成席夫碱，从而产生共价结合；取混合置于摇床，200r/min，25℃，30min；将氧化的四氧化三铁载体置于0.9％生理盐水中透析2～3h，再置于20mM碳酸氢钠缓冲液透析1h，得到无高碘酸钠的四氧化三铁载体溶液；取步骤(2)获得的c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸溶于同体积的超纯水中，将已透析好的氧化的四氧化三铁载体溶液加入其中，置于摇床上振摇，200r/min，25℃，24h，得到对比剂初步产物；取相当于载体2/5的1M硼氢化钠(还原剂)溶液加入初步产物溶液中，振摇30min室温，得到对比剂终产物；再将其置于0.9％生理盐水中透析，高效液相凝胶柱过滤，即得到本发明的纯化的对比剂，装入EP管，置4℃冰箱保存。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是：步骤(1)中载体制备的共沉淀一步法是：将三氯化铁和二氯化铁按摩尔比接近2∶1混合后加入葡聚糖，冲氮条件下搅拌并加入氨水及超纯水，保持PH值为碱性；之后在恒温磁力搅拌器中以800转/min、温度65℃的条件反应1h，加入适量冰乙酸，调节PH值；再将反应物1200转/min离心15min，取上清液，超纯水稀释100倍，放置透析袋过滤24h，0.22μm滤膜再过滤，超声振荡5min，高效液相色谱纯化，得到黑褐色的外包葡聚糖的四氧化三铁载体，密封并分装于5ml西林瓶中备用。