[发明专利]表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌及制法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及的是生物制品，本发明还涉及这种生物制品的制备方法。

(二)背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的以仔猪呕吐、严重腹泻和高致死率为特征的消化道传染病。该病是我国及世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。疫苗免疫接种是预防本病的主要措施。实践证明，肠道粘膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗TGEV感染的有效抗体，而非经口免疫所产生的其它血清抗体，如IgG、IgM对本病的免疫保护效果并不理想。因此选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统，有效的刺激粘膜免疫系统所产生的粘膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。

TGEV有三种主要结构蛋白，分别为磷酸化的核衣壳蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纤突蛋白S。其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；S蛋白含有宿主细胞氨肽酶受体(PAPN)的识别位点，因此，S蛋白对病毒感染、发挥其致病性和决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种能够用于防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的黏膜免疫活菌疫苗的表达猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteristis virus，TGEV)S蛋白的重组乳酸乳球菌及其制法。

本发明的目的是这样实现的：

它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 207020，命名为Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8112-Sa/NZ9000的重组乳酸乳球菌，保藏日期2007年2月14日。

本发明的重组乳酸乳球菌是采用这样的方法来制备的：

根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，以TS7和TS8为引物，进行PCR，获得含有TGEV S基因4个主要抗原位点的2007bp目的片段，将其与分泌表达的载体质粒pNZ8112进行连接，通过电转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内，在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达。

采用本发明的方法获得的产物经检验结果为：

1、乳酸乳球菌表达载体的酶切鉴定结果

经PCR扩增得到的2007bp片段经胶回收纯化，与载体质粒同时用相应的限制性内切酶进行双酶切并以胶回收试剂盒进行回收纯化后进行16℃过夜连接，连接产物电转化入宿主菌NZ9000，阳性重组质粒PCR鉴定后得到约2000bp的目的片段，单双酶切鉴定后分别得到与预期结果相一致的5300bp、2000bp和3300bp的目的片段(见图1)。序列测定结果分析表明TGEV S基因已插入到表达载体质粒中。获得的阳性重组菌命名为pNZ8112-Sa/NZ9000菌株。

2、TGEV S蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达及蛋白检测

对重组的pNZ8112-S/NZ9000菌株和pNZ8112/NZ9000空质粒的菌的诱导结果表明，重组蛋白获得了表达，蛋白大小约在66KDa左右。通过Western-blot检测表明重组蛋白具有与TGE全病毒制备的抗血清发生反应的能力，并具有良好的特异性，即反应原性。见图2。光密度扫描分析测定蛋白表达效率，表达的TGEV S蛋白在适宜表达条件下，光密度扫描分析表达蛋白含量为9.0％，见图3。

3、TGEV S蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达间接免疫荧光检测结果

以pNZ8112-Sa/NZ9000重组菌和pNZ8112/NZ9000对照菌所进行的间接免疫荧光实验结果表明，重组菌pNZ8112-Sa/NZ9000荧光显微镜检查可见明显的黄绿色荧光(图4)，由此也表明，重组菌所表达的外源蛋白是存在于菌体的表面位置；pNZ8112/NZ9000未发现绿色荧光，菌体被染成红色(图5)。

光密度扫描分析测定蛋白表达效率，表达的TGEV S蛋白在适宜表达条件下，光密度扫描分析表达蛋白含量见图3。

基于TGEV的肠道致病特点和粘膜免疫特点，本发明以TGEV起主要免疫保护作用的囊膜蛋白基因(S基因)主要抗原位点片段Sa插入到乳酸菌表达载体，构建了表达TGEV S蛋白的重组乳酸菌表达系统，以期获得TGEV口服活菌疫苗，依靠乳酸菌天然的抗菌抗腹泻作用和S蛋白刺激的特异性粘膜免疫作用，达到预防本病的目的。