[发明专利]花鲈白细胞介素8基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于花鲈白细胞介素8基因序列。

背景技术

白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)基因又称噬中性粒细胞激活因子或粒细胞趋化因子，属C-X-C型趋化性因子，是最早发现的趋化性因子。它由单核-巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞和肥大细胞等多种细胞经炎症刺激后产生，具有趋化和激活嗜中性粒细胞的能力，包括吸引噬中性粒细胞向炎症部位迁移，并诱导它们脱颗粒，释放溶菌酶，启动呼吸代谢爆发，增加细胞表面粘附分子的表达等多种功能，在炎症发生和发展过程中有重要的作用，是一种重要的免疫抗病基因。目前随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是当今病害防治的趋势。至今对花鲈免疫基因的研究还较少，尤其对IL-8的研究还属空白。

发明内容

本发明的目的是通过以近源物种IL-8基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的全表达序列。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。

本发明的目的通过以下技术措施实现：

1、总RNA的提取

解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。

2、cDNA第一链的合成

花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。

3、引物设计依据，引物合成的方法

从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)IL-8同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为180bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。

引物序列为：

F：5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’

R：5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA  3’

4、IL-8基因cDNA全序列的克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。

在3′端RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。

基因外侧引物：5’CAGAGAATCGGCACAGACAG 3’

基因内侧引物：5’GGCACAGACAGCAGATAAGG 3’

接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。

经过3′端RACE扩增后的序列再进行5′端RACE扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和oligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和oligodG进行第二次PCR扩增。

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’

基因外侧引物：5’CTGTCTGTGCCGATTCTCTG 3’

基因内侧引物：5’CACATCACCTGTCTTTTGGC 3’。

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。

5、对花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的测定

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈IL-8同源序列。