[发明专利]表达传染性法氏囊病毒VP3基因编码蛋白永生化细胞制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和细胞遗传学领域，尤其涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP3基因编码蛋白永生化细胞制备方法。本发明具有深远的研究性和广泛的应用性，包括用于研究宿主细胞免疫反应具有稳定性及可表达所需蛋白的哺乳动物细胞的永生化。

背景技术

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一种以损害鸡中枢免疫器官-法氏囊淋巴滤泡未成熟细胞为特征的急性高度接触性免疫抑制性传染病。1957年Cosgrove在美国Delaware的Gamboro镇首先发现此病，1962年Winterfield分离鉴定出IBDV。该病在美国及世界各国均有发生和流行。88-92年IBD在我国大面积爆发，发病率和死亡率高达30-70％，造成了巨大的经济损失。近年来，IBD的发生和流行出现了新的特征，即由临床感染转化为以亚临床感染为主、死亡率降低、免疫抑制作用增强。

IBDV病毒基因组为dsRNA，编码VP1、VP2、VP3、VP4、VP5共5种蛋白，除VP1由B片段编码外，余者均由A片段编码。其中VP2、VP3是病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳的主要成分。VP2具有一个构象依赖性(不连续)的中和抗原决定簇，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染(变异株和超强毒株除外)，故一般认为VP2是病毒的宿主保护性抗原；VP3具有一个非构象依赖性(连续)的抗原决定簇，是病毒群特异性抗原。VP4是一种具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟过程中起着重要作用。L⁵¹²A↓A⁵¹³和M⁷⁵⁵A↓A⁷⁵⁶分别对于VP2-VP4和VP4-VP3的剪切是必需的，但是VP4在翻译中和翻译后加工过程中会因其结构和拓扑学变化而行使功能。基因组A节段中大ORF上游并与之部分重叠的另外小ORF A编码非结构蛋白(NP)，即VP5蛋白。VP1是RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)，与病毒dsRNA复制有关，同时还具有鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达传染性法氏囊病毒VP3基因编码蛋白永生化细胞制备方法。

它的步骤如下：

1)自传染性法氏囊病毒浙江分离株(NB)的鸡胚成纤维细胞(CEF)适应毒中用蛋白酶K消化法抽提病毒dsRNA，长距离一步法RT-PCR扩增病毒全长cDNA，并以此为模板PCR扩增不同编码蛋白的基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI-neo构建表达质粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，经42℃热击转化CaCl₂法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞；

2)用Luria-Bertani Medium作为基础培养基，各培养1-3ml浓度为1-1.5OD600值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；

3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，各重组质粒经Opti-MEM稀释后在Lipofectamine2000介导下转染90-95％融合的生长活力旺盛的单层Vero细胞；

4)在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；

5)单克隆化细胞经PCR、RT-PCR、Southernblot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的永生化细胞。

本发明制备的表达传染性法氏囊病毒VP3基因编码蛋白永生化细胞，容易培养，增殖快速，可无限扩大，性质稳定，易保存，研究方便。方法技术成熟，重复性强，一般研究人员就可完成。

附图说明

图1是传染性法氏囊病毒基因组及编码蛋白的物理图谱；

图2是真核细胞表达载体pCI-neo的质粒图谱；

图3是IBDV A片段编码基因的PCR扩增电泳图；

图4是IBDV系列VP2截断体克隆化细胞的RT-PCR电泳图；

图5是IBDV VP5基因克隆化细胞系的Southern blot图；

图6是IBDV编码基因克隆化细胞Northern blot图；

图7是IBDV编码基因克隆化细胞IFA/IPMA图。