[发明专利]农杆菌介导的花椒转基因方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种农杆菌介导的花椒转基因方法。

背景技术

朝仓花椒(Zanthoxylum piperitum DC var.inerme Makino)芸香科花椒属落叶灌木。花椒用途广，是一种重要的经济树木，其果实不但能入药、榨油，且为人们日常烹饪的主要调料。现代研究表明花椒属植物的化学成分主要有生物碱、酰胺、木脂素、香豆素和脂肪酸等，对心血管系统、消化系统、免疫机能、凝血功能、肿瘤等具有较强的药理活性。研究发现花椒宁碱对癌细胞逆转录酶和DNA聚合酶活力有较高的抑制能力，因此对花椒中抗癌活性物质的研究，是国内外学者研究的热点。花椒树喜光、喜温，耐干旱，不耐涝，不耐寒。冻害常给花椒生产造成重大损失，造成花椒大量减产，甚至绝收。我国是世界花椒栽培面积、产量第一大国，但我国花椒研究主要以丰产栽培和病虫害防治为主，而良种选育及产品开发严重滞后。如不从根本上解决良种问题，花椒的生产水平难有大的发展，因此当前急需开展优良品种的选育研究。

转基因育种相对于传统的杂交育种、诱变育种和多倍体技术育种来说，不仅缩短了育种周期，而且能准确地选择任何一个目的基因(植物、动物乃至人类)，从而打破了遗传物质分类上门、纲、目、科及属界限，实现了基因的转移，大大拓宽了作物遗传改良可资利用的基因来源。

由于木本植物自身的特点，使其在遗传转化上有一定的难度和特殊性，只有建立快捷高效的遗传转化体系，完善和优化转基因技术，才有可能提高转化率，获得大量的转基因植株，筛选优良株系，培育优良品种。由于缺少高效的花椒组织培养再生体系，目前尚未见国内外有关花椒遗传转化及转基因育种研究方面的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一为培育抗病虫、抗低温、抗干旱，高精油含量、高药用价值及无刺的转基因花椒的农杆菌介导的花椒转基因方法。

一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤：

(1)材料消毒方法：田间取外植体在流水中冲洗2h，用少量洗衣粉刷洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分冼净，75％酒精表面消毒45s后无菌水冲洗1次再用0.1％升汞消毒7min后无菌水冲洗5次，切取0.5-1cm带腋芽茎段接种于诱导培养基；

(2)农杆菌的准备：用接种针蘸取-80℃冻存的含有pBin19重组质粒的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28℃恒温培养24-48h至长出合适大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7；将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体；用WPM重悬培养基重悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3-0.4之间；

(3)植物材料的农杆菌侵染：取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h，投入预先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6-8min后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上，培养48-72h。立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；

(4)分化及壮苗：材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生3个月后愈伤组织再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗长至3-4公分高；

(5)完整植株的获得：将小苗转至生根培养基中诱导生根，2周后材料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植株试管苗。

其中：植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度(26±2)℃。

生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规培养基。

上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：共培养基中含有0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖。

上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：诱导培养基中含有0.5mg/L-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培养基1中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。

上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：1/2WPM生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。