[发明专利]一种过氧化物酶测定用显色液体系及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种过氧化物酶测定用显色液体系及其制备方法。

背景技术

过氧化物酶显色液体系是免疫学、免疫组织化学等研究及检测领域常用的显色示踪系统。目前在临床和科研方面都有广泛应用。其基本原理为：过氧化物在有过氧化物酶存在条件下发生分解反应，并释放氧化态氧(O-)，氧化态氧(O-)与显色体系中的无色供氢体(生色物)发生氧化还原反应，生色物被氧化，氧化态的生色物产生颜色。反应完成后，显色体系颜色深浅直接指示反应体系中被检测物质含量。从而实现定性或定量检测。但由于显色体系中的过氧化物和生色物之间存在着较高的标准电势差，同时过氧化物本身理化性质不稳定，因此在无过氧化物酶参与的情况下，它们之间仍然能够发生一定程度的氧化还原反应。过氧化物酶显色液体系在平时保存过程中需要把过氧化物和生色物两种物质分开保存，在进行测定时再临时混合在一起。这样的实验流程增加了实验人员操作的复杂性，同时由于长时间加样，检测结果的真实性也受到影响。

为解决上述问题，给该领域的测定带来方便，目前试图采用一种方法，使过氧化物和生色物能够长期稳定共存在一种溶液中而不发生反应，而当用其测定过氧化物酶时其灵敏度不变。但是现有的混合显色体系仍存在着发生自显色的问题，主要原因是由于体系中过氧化物(H₂O₂类物质)不稳定，容易受光照、重金属离子、溶液高pH值(pH＞6.0)或温度影响发生分解，分解反应产生的氧化态氧(O-)氧化生色物而产生变色现象。例如，美国专利4,891,314中采用青霉素作3.3’5.5’一四甲基联苯胺(TMB)与H₂O₂的稳定剂，但它们共存的时间最多只有几个星期；美国专利5,206,150中采用杆菌肽作TMB与H₂O₂两种存储液的稳定剂，叙述了特殊的配制条件和方法，其二合一底物要求避光保存在2-4℃条件下，而且操作也过于繁琐。日本专利特开平6-2279采用有机溶媒使二合一得以实现。结果是各种溶媒大大抑制了TMB与过氧化物的反应，以致临床操作中发现其检测灵敏度受到限制，要求有很高的过氧化物酶浓度来完成测定，这样降低了该发明的实用性。

发明内容

本发明实施例要解决的技术问题在于提供一种过氧化物和生色物能够长时间稳定共存而不发生反应，容易保存且测定时灵敏度不变的过氧化物酶测定用显色液体系。

本发明实施例要解决的另一技术问题在于提供一种上述过氧化物酶测定用显色液体系的制备方法。

本发明实施例提供的过氧化物酶测定用显色液体系，由过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷、3.3’5.5’一四甲基联苯胺和硫代硫酸钠、pH值为5.0-6.0的缓冲液组成，所述重金属离子络合剂为通式(I)化合物

其中R₁’和R₂’分别为高级脂肪烷基，其单独所具有的碳原子数为10-15。

上述过氧化物酶测定用显色液体系制备方法，包括如下步骤：

(1)取过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷分别加入到pH值为2.5-5.5的缓冲液中混匀后作为存储液I备用；

取3.3’5.5’一四甲基联苯胺溶于丙酮，将所得溶液溶于乙醇中，再将乙醇溶液加入到pH值为2.5-5.5的缓冲液中混匀，取硫代硫酸钠加入到缓冲液中，混匀后作为存储液II备用；

(2)将存储液I和存储液II混合后调节缓冲液pH值为5.0-6.0后定容。

本发明实施例中，由于使用强还原剂硫代硫酸钠作为生色物的保护剂，能够保护其不受正常分解的过氧化物氧化；由于使用上述重金属离子络合剂(EP-110)，络合缓冲液中可能存在的重金属高价阳离子，能消除重金属离子对过氧化物的催化分解作用；由于使用复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷(巴松-1789)，可有效吸紫外线中UVA波段(320～400nm)紫外线，有效减少日照对过氧化物的分解作用；由于过氧化物选择使用了过氧化脲，能解决室温或高pH值条件下H₂O₂的自分解问题。而且，本发明实施例所需备成份均为实验室常用试剂或食品化妆品行业使用原料，试剂对人体无直接或间接伤害作用，试剂配制过程简单，所配制成的显色液体系，在室温下保存12个月不会失效，也不用避光保存。

附图说明

图1为本发明实施例1混合显色液体系检测结果图；

图2为本发明对比混合显色液体系检测结果图；