[发明专利]一种奶牛再克隆的方法

说明书

技术领域

本发明属于胚胎生物工程领域，特别是一种奶牛再克隆的方法。

背景技术

克隆绵羊Dolly的诞生，动物克隆从此进入体细胞克隆时代。紧随Dolly羊之后，许多实验室开展体细胞克隆研究，各种克隆动物相继问世(Baguisi，1999；Wakayama，1998；Kao，1998；Onishi，2000；Shin，2002；Chense，2002；Galli，2003；Woods，2003)。通过体细胞克隆技术，人们可以获得无数同质个体，克服了胚胎细胞克隆只能达到有限个体的缺点。目前该技术除了在动物保种繁衍方面的应用之外，已在转基因方面、胚胎干细胞方面得到了应用，已显示出诱人的应用前景。

体细胞克隆技术是动物保种重要方法之一。通过体细胞克隆技术进行保种，可以把一个动物的体细胞变成一只动物。如果要保存一个物种，就可以先拟定出保持遗传稳定性的动物个体数，然后在每一头动物身上采集成千上万细胞，进行永久性保存，若需重现一个动物物种或品种时，只需进行同种或异种克隆，就可以获得这种动物。一个动物的体细胞可以保存在一个小管内，一个品种或一个物种就可以保存在一个小盒内，我国的动物物种也许可以装在一间大房里，这样就可以建立一个名副其实的基因库。Comizzoli等(2000)认为体细胞核移植也为拯救珍稀濒危动物开辟了一条新的途径。1998年新西兰的Wells等(1999)利用这一技术成功地克隆了当地一头濒临灭种土种牛2000年美国的Lanza等(2000)通过种间核移植的方法用家牛的卵母细胞获得了种间核移植胚胎，移植到家牛后获得了妊娠并生出了后代；1999我国陈大元等用兔卵母细胞获得了种间核移植的大熊猫胚胎，这些结果表明通过体细胞核移植方法增加濒危动物的数量是可行的，通过种间核移植方法保护珍稀动物可能在不久的将来会有突破性的进展。

体细胞克隆技术还处于研究阶段，体细胞克隆还存在一些问题：

1)结果不稳定，效率低  目前，克隆绵羊只有3％左右的重组胚能发育为正常后代。在克隆牛的研究过程中，根据kato等的结果，重组胚的囊胚发育率最高能达到49％，约有80％的移植胚能发育为正常胎儿，但胎儿出生后的死亡率达到50％。Cibelli等在克隆牛的生产过程中，重组胚的囊胚率仅为17％，移植后只有14％的囊胚发育正常后代。克隆小鼠仅在夏威夷大学医学院获得成功，只有2％-3％的重构胚能发育产仔，仔鼠死亡率也高达40％o以上结果表明体细胞克隆技术仅处于初步研究阶段，还需要在其他动物上进一步研究，提高生产效率。

2)后代死亡率高  胎儿出生后的高死亡率也是体细胞克隆面临的问题之一，出现这一现象的原因还不清楚。目前只能从优化培养条件及操作程序入手以减少胎儿死亡率。

3)用其它体细胞作供体的探索  目前，用于体细胞克隆的供体细胞种类很有限，其它细胞通过核移植能否成功有待进一步探讨。

4)细胞质遗传问题在小鼠和牛的克隆研究中，人们发现细胞质的遗传物质影响克隆后代的表型，如花斑、毛色等，这是由供体细胞线粒体DNA，还是由卵子细胞质中的遗传物质引起还不清楚。细胞质中的遗传物质对克隆后代的其它性状是否产生影响还需要进一步探讨.随着克隆技术的发展，细胞质中遗传物质的作用会越来越引起人们的重视。

5)供体细胞的保存和细胞周期的影响  体细胞克隆的最大优势之一是供体细胞可培养传代及冷冻保存。但在传代及冷冻过程中，细胞核中遗传物质的损伤及变异势必影响克隆胚胎的发育。同时，供体细胞周期直接影响克隆效率，但对这些问题目前知之甚少，急需加以研究。

用克隆动物的体细胞再次进行克隆，称为再克隆。在理论上，通过克隆和再克隆，可获得无限多的克隆动物。再克隆技术与克隆技术基本原理是一致的，但再克隆技术进一步放大克隆效果，延伸克隆的内涵，进行再克隆研究将有助于解决上述问题。

发明内容

本发明针对上述领域中的缺陷，提供一种奶牛的再克隆方法，使克隆效果再次放大，是提高克隆效率的有效方法之一。