[发明专利]带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法及应用

权利要求书

1.一种带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法，其特征是该方法的制备步骤如下：

第一、合成辅助识别聚合物链：以二甲基亚砜为溶剂，以N，N-二异丙基碳二亚胺及1-羟基苯并三唑为缩合剂，使得聚合度在40-50的短链聚乙烯醇上10％-8％的羟基与芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸进行接枝反应，聚乙烯醇与两种缩合剂以及芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸的比例为：每克聚乙烯醇，使用1mLN，N-二异丙基碳二亚胺，2g 1-羟基苯并三唑，8g芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸；之后，加入体积比为1∶1的吡啶与丙烯酰氯的混合物，使得聚乙烯醇上另外10％-8％的羟基与丙烯酰氯发生接枝反应，然后加入哌啶脱去甘氨酸上的保护，用乙醇沉淀，离心，干燥，即得到辅助识别聚合物链；

第二、对载体进行修饰：取80-100目在二甲基亚砜中溶胀后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反应4h，使得微球上的羟基接枝上丙烯酰基，之后用乙醇洗涤并过渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体；

第三、合成蛋白质印迹树脂：在磷酸盐缓冲溶液中，摩尔比为300∶1的辅助识别聚合物链与克隆的猪亲环素18蛋白质于4℃进行自组装8小时，之后往溶液中加入的湿的经过双键修饰的聚乙烯醇树脂微球吸附16小时，湿的经过双键修饰的聚乙烯醇树脂微球与克隆的猪亲环素18蛋白质的质量比为1000∶3；随后加入质量比为29∶1的丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液、过二硫酸铵溶液，室温通氮除氧1h，然后加入N，N，N′N′-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用500mMKCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无猪亲环素18蛋白质条带，得到蛋白质印迹树脂。

2.权利要求1所述方法合成的蛋白质印迹树脂在蛋白质分离中的应用，其特征在于，该应用方法包括下述步骤：

第一、4℃下，将计量的权利要求1制备的蛋白质印迹树脂直接放入猪肝细胞提取物中，吸附1小时；

第二、上步吸附蛋白后的蛋白质印迹树脂依次用0.02M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲液洗涤6次、2mL0.10M氯化钾溶液洗涤2次、2mL0.15M氯化钾溶液洗涤1次、0.30M氯化钾溶液洗涤2次，0.50M氯化钾溶液洗涤1次，得到洗涤液；

第三、应用Bradford法检测上步得到的氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取部分洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测，吸附蛋白中猪亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值。