[发明专利]一种生物芯片标记和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物芯片标记和检测方法。

技术背景

由于无机纳米粒子(金，银，量子点等)具有特殊的物理和化学性质，近十年来被广泛应用于各种纳米技术，生物纳米技术和生物医学检测技术等领域(化学综述，Chem.Rev.2004，104，293-346；Chem.Rev.2005，105，1547-1562)。表面增强拉曼(SERS)是一种非常灵敏的光学检测手段，其理论检测限可以达到单分子，并且能定量与定性同时进行(化学物理B，J.Phys.Chem.B，1997，101，1338；拉曼光谱杂志，J.Raman Spectrosc.2005，36，485)。生物芯片是目前基因组学，蛋白质组学研究的重要工具，具有高通量，并对检测样品消耗量少等优点(基因生物学，Genome Biol.2001，2，research 0004.1～0004.13)。但目前，生物芯片主要以荧光为检测手段，因而在检测灵敏度，选择性等方面尚具有一定的缺点；拓展生物芯片的检测手段对其发展有重要意义(Nature，2007，4，437-444)。将金纳米粒子标记生物芯片和表面增强拉曼检测生物芯片方法相结合，有助于提高生物芯片的灵敏度，重现性和选择性。

发明内容

以多肽混合物如胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘氨酸修饰金纳米粒子具有合成方法简单，快速并且稳定性好，生物相容性好等优点。而亲和素-生物素(avidin-biotin)是目前发现的最稳定的配合物。本发明利用亲和素-生物素反应以多肽如胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘氨酸修饰的金纳米粒子标记物；通过拉曼染料修饰亲和素与生物素反应标记生物芯片，并结合表面银增强技术以SERS为检测手段，研制一种生物芯片标记与检测方法；并实现多肽，蛋白质检测和蛋白质之间相互作用和酶与底物之间相互作用的研究。

本发明的目的是提供一种生物芯片标记和检测方法；一种以金纳米粒子标记物，表面增强拉曼为检测手段的生物芯片标记和检测方法。

本发明的方法的具体的技术方案如下：

图1是本发明的方法的技术路线示意图。其中，a)是多肽检测；b)是检测酶与底物相互作用；c是蛋白质检测。

(1)多肽修饰金纳米粒子的合成，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液以摩尔比1∶50000混合，常温反应1小时后，在转速为13000转/分钟的条件下通过3次离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；

所述的多肽混合溶液为胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘氨酸的混合溶液；

将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存。

(2)标记生物芯片，将以美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法制作的多肽或蛋白质生物芯片与200μL的浓度为100ng/mL-100μg/mL的拉曼活性染料标记的亲和素(avidin)和浓度为5.0×10^-9M的多肽修饰的金纳米粒子，在37℃反应1小时，得到标记生物芯片；得到的标记生物芯片清洗并用N₂吹干。

所述的生物芯片包括：多肽浓度为1ng/mL-1mg/mL的点阵的多肽芯片，含蛋白A(protein A)浓度为10ng/mL-1mg/mL的点阵的蛋白质芯片；多肽底物浓度为1ng/mL-1mg/mL的点阵的多肽底物芯片。

(3)银增强反应，为了进一步提高检测灵敏度，将标记的生物芯片与1mL银增强溶液反应10分钟；所述银增强试剂为美国西格玛(Sigma)产品，包括溶液A(硝酸银，AgNO₃)与溶液B(氢醌)两种溶液，使用时溶液A与溶液按1∶1混合。

(4)以表面增强拉曼检测上述生物芯片，具体条件和步骤如下：将上述生物芯片放置于雷尼绍(Renishaw)2000型激光共聚焦拉曼光谱仪的显微镜样品台上，以氩离子激光器产生的能量为10毫瓦波长为514纳米的激光为激发波长，使用CCD检测器采集拉曼光谱，每条拉曼光谱的采集时间为10秒。

本发明的有益效果明显：(1)本发明提供一种多肽修饰金纳米粒子标记方法，与其他金纳米粒子标记方法相比具有，简单，稳定，快速等优点。