[发明专利]抑制人类细胞周期蛋白A2表达的siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和生物医学领域。本发明涉及特异性抑制人类细胞周期蛋白A₂(cyclin A₂)的siRNA及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interfering，RNAi)是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。RNAi首先由Andrew Fire等于1998年首先在秀丽线虫中发现，随后被广泛发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。Elbashir SM等于2001年利用人工合成小分子双链RNA在哺乳细胞中发挥RNAi作用，自此以后，RNAi成为分子医学强有力的工具。

人类细胞周期蛋白A₂是细胞周期蛋白家族的一员，参与G1/S期和G2/M期转换，在DNA复制、转录过程中发挥重要的作用。过高的人类细胞周期蛋白A₂表达水平导致S其缺陷和染色体的不稳定，其表达水平失常参与肿瘤转化和肿瘤发生的过程。在星形细胞瘤、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胃癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌等都发现人类细胞周期蛋白A₂过量表达，且其高表达水平是肝癌、非小细胞肺癌、头颈癌、胃癌、白血病等的不良预后的标志。因此下调或抑制人类细胞周期蛋白A₂是肿瘤治疗的一种有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供异性抑制人类细胞周期蛋白A₂的siRNA及其应用。

本发明的第一方面中，提供特异性抑制人类细胞周期蛋白A₂的siRNA，所述的siRNA对应的靶序列是人类细胞周期蛋白A₂的mRNA，所述的siRNA长度为16-30bp，含有如下所示的核酸序列：

5’-CCA UUG GUC CCU CUU GAU UTT-3’

5’-AAU CAA GAG GGA CCAAUG GTT-3’  (SEQ ID NO：1)；

较佳地，所述的siRNA的3’端含有2-4个dT或2-6个U的延伸结构；

所述的siRNA以己二胺功能化的碳纳米管为载体，经转染使K562细胞的人类细胞周期蛋白A₂的mRNA表达水平下降60-95％。

本发明的第二方面涉及所述的siRNA的应用，所述的siRNA用于制备抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的治疗肿瘤的药物。所述的siRNA作为该药物的活性成分，其质量含量为0.001-99.999％。

如附图所示，将如上所述的siRNA转入K562细胞，用RT-PCR和免疫印迹检测其对人类细胞周期蛋白A₂表达的抑制，用苔酚蓝拒染法计数和软琼脂克隆形成实验检测其对细胞增值的影响，用流式细胞仪检测亚二倍体峰(subGlpeak)和DNA ladder gel电泳检测凋亡DNA片段来观察其对细胞凋亡的影响。结果表明：RT-PCR和免疫印迹实验显示如上所述的siRNA能特异性抑制人类细胞周期蛋白A₂的表达，抑制效率在70％以上；苔酚蓝计数显示如上所述的siRNA能显著抑制细胞生长；软琼脂克隆形成实验显示如上所述的siRNA能显著抑制细胞增值；流式细胞检测亚二倍体峰实验和DNA ladder gel电泳实验显示上所述的siRNA能促进细胞凋亡。

附图说明

图1：RT-PCR检测本发明所述siRNA对人类细胞周期蛋白A₂ mRNA表达水平的影响图。

图2：免疫印迹检测本发明所述siRNA对人类细胞周期蛋白A₂蛋白表达水平的影响图。

图3：苔酚蓝拒染细胞计数检测本发明所述siRNA对肿瘤细胞生长的影响图。

图4：软琼脂克隆形成实验检测本发明所述siRNA对肿瘤细胞增殖的影响图。

图5：流式细胞仪检测本发明所述siRNA对肿瘤细胞凋亡的影响图。

图6：DNAladder gel电泳检测本发明所述siRNA对细胞凋亡的影响图。

具体实施方式

实施例1：siRNA的合成

本发明施例中的针对人类细胞周期蛋白A₂的siRNA是根据Elbashir userguider原则设计，针对人类细胞周期蛋白A₂ mRNA的524-544位点选取的一段21bp的siRNA，其序列如下所示：