[发明专利]华蟾毒精的免疫调节新用途

说明书

一、技术领域

本发明涉及华蟾毒精的免疫调节作用，属于医药领域范围。

二、背景技术

华蟾毒精(Cinobufagin，CBG)是蟾蜍有效成分之一，化学名为：5beta-Bufa-20，22-dienolide，

14，15beta-epoxy-3beta，16beta-dihydroxy-，16-acetate(8CI)。其结构如下：

具强心、升压、局部麻醉、抗肿瘤等作用，但其对机体免疫功能的影响尚未见报道。本发明研究了华蟾毒精对小鼠免疫功能调节作用，并初步阐明其免疫增强作用的机制，为寻找新的有效的中药免疫增强剂提供一定的科学依据。

三、发明内容

通过MTT法检测CBG单独作用及协同刀豆球蛋白A(Con A)或脂多糖(LPS)作用对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响，通过MTT法和中性红吞噬实验检测CBG对腹腔巨噬细胞(Peritonealmacrophage，PMΦ)能量代谢水平及吞噬功能的影响；通过流式细胞术检测CBG对正常小鼠脾淋巴细胞周期及脾中T淋巴细胞表面抗原CD4、CD8表达的影响。

四、具体实施方式

1材料与方法

1.1实验动物

健康Balb/c小鼠，雄性♂，6-8周龄，体重(20±2)g，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(吉2003-0001)。

1.2药品及试剂

1.2.1华蟾毒精来源

华蟾毒精购自于中国生物制品检定所。

1.2.2试剂及配制

华蟾毒精单体为脂溶性药物，配制时用DMSO(终体积＜0.1％)助溶。刀豆球蛋白A(Con A Type IV)、脂多糖(LPS)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、台盼蓝(Trypan Blue)均为Sigma产品，RPMI-1640培养基(RPMI-1640完全培养基配制：100U·mL^-1青霉素、100g·L^-1链霉素、1％谷氨酰胺、10％灭活新生牛血清，pH7.2)、胰蛋白酶均为Gibco产品，CD4/L3T4-PE、CD8a/Lyt-2-FITC荧光标记抗体均为Southern Biotech产品。

1.3 MTT法测定小鼠脾淋巴细胞转化率

无菌取小鼠脾，制备成5×10⁶个·L^-1的淋巴细胞悬液，每孔100μL加入96孔培养板，再每孔100μL加入含不同浓度CBG的RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10、15mg·L^-1(单药组)，或加入不同浓度CBG(0.5、1.0、2.5、5.0、10、15mg·L^-1)和ConA(5mg·L^-1)或LPS(20mg·L^-1)的混合液(组合药物组)，同时设阳性、阴性和空白对照组，每组均设4复孔。37℃、5％CO₂培养箱中连续培养44h，每孔20μL加入MTT液，继续培养4h，用TECAN酶标仪(奥地利产品)于570nm处测定吸光度A，结果以刺激指数(SI)反映小鼠脾淋巴细胞增殖、转化率的高低：SI＝药物刺激孔A/阴性对照孔A

1.4小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平及吞噬功能的测定

制备、纯化小鼠PMΦ，计数细胞密度为5×10⁶个·L^-1，每孔100μL加入96孔培养板，再每孔100μL加入含不同浓度CBG的RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、2.5、10mg·L^-1(单药组)，或加入不同浓度的CBG(0.5、2.5、10mg·L^-1)和ConA(5mg·L^-1)或LPS(20mg·L^-1)的混合液(组合药物组)，同时设阳性、阴性及空白对照组，每组均设4复孔。37℃、5％CO₂培养箱中培养20h，每孔20μL加入MTT，继续培养4h，于570nm处测定吸光度。另取PMΦ，加药法同上，培养24h，1800×g离心10min弃上清，每孔100μL加入中性红1g·L^-1生理盐水液，继续培养30min；PBS洗板2次，每孔100μL加入细胞溶解液(乙酸∶无水乙醇＝1∶1 V∶V)，室温静置过夜并于540nm处测定吸光度。