[发明专利]固定化脂肪酶催化合成α－亚麻酸单甘油酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物原料的合成方法技术领域，特别涉及一种通过固定化脂肪酶法催化合成抗癌药物原料α-亚麻酸单甘油酯的方法。

背景技术

α-亚麻酸单甘油酯主要存在于中药薏苡仁中。α-亚麻酸单甘油酯作为一种非细胞毒性抗癌物质，具有抑制肿瘤生长，调节机体免疫功能的作用。其作用环节主要是诱导细胞凋亡，并能逆转耐药的肿瘤细胞，与化疗有协同作用。在临床上，薏苡仁主要用于治疗鼻咽癌。

α-亚麻酸单甘油酯传统的制备方法是从原料药薏苡仁中通过有机溶剂进行提取，与本发明相近的现有技术是一篇论文，名称为“油相干燥法制备薏苡仁酯微胶囊最佳工艺研究”，源自《时珍国医国药》2006年第17卷第1期。其方法主要采用丙酮分3次对薏苡仁粉末进行提取，得到粗提掖后，加入石油醚，滤除白色絮状物，滤液减压蒸馏，得到薏苡仁提取液。然而，传统的方法有很多的缺点：(1)原料药薏苡仁价格较高，并且薏苡仁本身含有α-亚麻酸单甘油酯的量很少(约为1.31％)；(2)提取工艺非常复杂，提取物纯化困难，费用高；(3)制备过程中大量使用有机溶剂，导致药物中有机溶剂残留量超标。因此采用传统制备方法，严重地阻碍了α-亚麻酸单甘油酯作为抗癌药物的原料的广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，1.通过对介孔材料进行扩孔以及表面修饰，通过交联法使脂肪酶分子组装进载体孔道中，从而保证介孔材料固定化酶在有机相中的高稳定性，以及维持脂肪酶的原活性；2.在有机介质正己烷或乙酸乙酯中合成治疗癌症的药物原料α-亚麻酸单甘油酯。

介孔分子筛孔道中功能材料的组装，特别是生物大分子酶蛋白的组装固定，是目前国际上介孔材料研究的热点之一。由于介孔材料孔径的限制，组装固定的基本都是小分子量的酶，而实际应用的一些酶类分子量往往很大，如脂肪酶的分子量约30000左右，酶分子的平均动力学直径约为5nm。常规方法合成的介孔材料SBA-15的孔径虽然能够能达到6nm，但通过实验证明，脂肪酶只能吸附到材料表面，而不能进入孔道内。

本发明的技术方案包括将脂肪酶在扩孔后的SBA-15中进行组装制成固定化酶，再将固定化酶在有机介质中进行α-亚麻酸单甘油酯的合成。

本发明的固定化脂肪酶催化合成α-亚麻酸单甘油酯的方法具体过程如下：

步骤A.制备固定化酶载体：以三嵌段共聚化合物P123(EO₂₀PO₇₀EO₂₀)为模板剂，用盐酸(HCl)调节pH值，水为溶剂，正硅酸乙脂(TEOS)为硅源、乙醇为扩孔剂；摩尔配比为如下范围：0.8～1.0模板剂/40～60硅源/300～350HCl/7500～10000H₂O/300～350扩孔剂；将P123溶于水中，加入盐酸搅拌溶解；加入正硅酸乙酯(TEOS)在50℃～60℃恒温搅拌30～45min后加入乙醇，搅拌后装入反应釜中，在100℃烘箱中放置48小时；将产物过滤，洗涤，干燥，再经过500℃～550℃灼烧6～8小时可完全除去表面活性剂，得到介孔材料，产品名称为：SBA-15/80。将介孔材料SBA-15/80分散于水中，二者质量∶体积比为1g∶20～50ml，加热回流3～4h，混合物冷却后离心分离，除去水分，白色固体在空气中干燥5～6天。取水合后的介孔材料先后加入100～150ml甲苯和10～20ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加热回流4～6h。反应结束后，产物过滤，经氯仿洗涤，室温干燥，即得白色产物固定化酶载体，记为：NH₂-SBA-15/80。

步骤A对介孔材料SBA-15进行了扩孔和修饰。扩孔和修饰后的固定化脂肪酶载体可通过X射线衍射，透射电镜，红外光谱，热重-差热分析进行表征。

步骤B.制备固定化脂肪酶：取介孔材料NH₂-SBA-15/80(固定化酶载体)与交联剂戊二醛，在搅拌情况下反应2～4h，之后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤以除去未反应的戊二醛。再向介孔材料NH₂-SBA-15中加入20～40ml脂肪酶溶液反应4～6小时；按质量体积比为1g固定化酶载体/20ml～40ml交联剂/20～40ml脂肪酶溶液；最后用PBS洗涤并离心，直到在溶液中检测不到蛋白为止。脂肪酶溶液的浓度可以是16～20mg/ml。

一般情况下可以在离心转速5000rpm下离心10～15min即可。

前述的脂肪酶最好是假丝酵母脂肪酶或铜绿假单胞菌脂肪酶。交联剂也可以使用鞣酸。