[发明专利]乙酰胆碱酯酶的提取方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种从鲫鱼的脑、肌肉及肝脏中提取乙酰胆碱酯酶的方法及用其快速检测有机磷农药残留量的方法。

背景技术

现有《一种从动物血液中提取乙酰胆碱酯酶的制备方法》(专利申请号02134464)，包括以下工艺步骤：将大白鼠、鸡、鸭、牛、狗、兔、黄鳝鱼、鳗鱼的血液于室温下凝固，冷冻，取其上清液，上清液离心分离，得乙酰胆碱酯酶粗提液，用硫酸铵沉淀法纯化，用透析法脱硫酸铵，酶液浓缩干燥，得纯化的乙酰胆碱酯酶制品。

有用乙酰胆碱酯酶检测农药残留量，如《一种重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和检测方法》(专利申请号200610028885)，用于农产品中农药残留的检测，用二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)作显色剂，硫代丁酰胺胆碱为底物，通过比色，最后计算抑制率(％)。还有《一种常规农药快速残留检测方法》(专利申请号02148533)，以小白鼠肝脏乙酰胆碱酯酶作为酶源，以乙酰代胆碱为底物，底物在乙酰代胆碱酯酶的作用下，水解生成硫代胆碱与二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)，起显色反应，通过固定酶作用比较不同浓度杀虫剂作用的OD[412nm]值，制定标准曲线，将待测样品经过浸渍萃取后测得OD[412nm]值，根据待测样品的OD[412]值，判定待测物中农药残留浓度及抑制率。还有以乙酰胆碱酯酶为酶源，2，6-二氯靛酚乙酸酯为显色剂，2，6-二氯靛酚乙酸酯为显色剂国内尚没有，价格昂贵，每250mg达1000元以上。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种成本低、检测有机磷农药残留量速度快、灵敏度高的鲫鱼乙酰胆碱酯酶的提取方法及应用。

本发明目的的实现方式为，乙酰胆碱酯酶的提取方法，分别取鲫鱼脑、肌肉和肝脏各组织，用pH7.5，0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，在冰浴条件下匀浆，制成匀浆液，匀浆质量体积比为1∶4，在4℃下，以10000～12000r/min冷冻离心25～30min，得上清液，即为乙酰胆碱酯酶提取液，保存于冷藏室中。

乙酰胆碱酯酶的应用，用于快速检测有机磷农药的残留量，检测方法是以鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶为酶源，以2，6-二氯靛酚钠为显色剂，以定性滤纸为载体并以吸附法固定化酶制得有机磷农药快速检测试纸，具体操作步骤如下：

取一张硬纸片，对称地粘上直径10±2mm的小滤纸片，一边加入润湿滤纸量的，浓度为0.5％的2，6-二氯靛酚钠溶液和润湿滤纸量的，浓度为100mmol/L的碘化硫代乙酰胆碱溶液，另一边加上润湿滤纸量的提取出的鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶溶液，放入冰箱中冷藏干燥20小时以上，小滤纸片上盖上同样大小的纤维滤膜，检测时，取用有机磷农药洗脱液湿润的滤纸片，对折使两滤纸片叠合，10～15分钟后观察试纸变色现象，无有机磷农药存在时试纸在10～15分钟内由蓝色变为无色，有有机磷农药存在时蓝色不褪或退色不明显。

本发明分别由鲫鱼脑、肌肉和肝脏各组织提取乙酰胆碱酯酶并以鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶为酶源，首次以DCIP(2，6-二氯靛酚钠)为显色剂，代替2，6-二氯靛酚乙酸酯，降低了成本，25gDCIP仅200元；检测有机磷农药残留量快速，仅为15分钟，灵敏度高。

附图说明

图1为用本发明提取的乙酰胆碱酯酶检测敌敌畏的10分钟显色反应图

图2为用本发明提取的乙酰胆碱酯酶检测敌敌畏的15分钟显色反应图

图3为用本发明提取的乙酰胆碱酯酶检测敌敌畏的20分钟显色反应及与空白对照显色图

具体实施方式

本发明分别取鲫鱼鱼脑、肌肉和肝脏各组织，用磷酸缓冲溶液匀浆，冷冻离心，得上清液，即为乙酰胆碱酯酶酶液，保存于冷藏室中。

本申请人作了乙酰胆碱酯酶活性的测定，具体操作是：在3.00mL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.0)中加入20μL乙酰胆碱酯酶液，混匀，30℃保温20min后，依次加入100μLDTNB溶液(20mmol/L)和20μLATCh(碘化硫代乙酰胆碱)溶液(100mmol/L)，充分混合反应，在412nm处用1cm比色皿比色，每隔0.5min读数，连续测定3min，酶活力单位定义为每毫克蛋白每分钟催化分解底物1μmol为1个活力单位U，检测结果按下式计算：