[发明专利]一种红细胞快速冰箱冻存和解冻方法及其使用的冰冻保护液和洗涤液

说明书

技术领域

本发明涉及一种红细胞的长期保存技术。

背景技术

现有技术均是将红细胞先悬浮在高渗透压冻存保护液中，其中主要有效成分是甘油或DMSO(二甲基亚砜)。

例如：Meryman液：57％甘油，3％乳酸钠，0.2％Na₂HPO₄，0.03％KCl。

Huggins液：79％甘油，8％葡萄糖，1％果糖，0.3％EDTA-2Na。

Krijnen液：35％甘油，2.9％山梨醇，0.63％NaCl。

Valeri液：35％甘油，2.88％甘露醇，0.65％NaCl。

其工作原理是让高渗透压甘油渗入红细胞内部，置换出其中的水份，从而减少在冻存过程中红细胞内外冰晶的形成，保护红细胞不被破坏。在红细胞解冻的过程中，由于红细胞内部的高渗状态，必须通过逐步降低红细胞洗涤液渗透压的方法，用渗透压逐渐降低的洗涤液，将红细胞内部的甘油或DMSO重新置换出来，以防止红细胞内部渗透压相对过高而造成的红细胞涨破。整个过程需要2—3小时左右。红细胞的回收率大约在70％-85％。如果将融解的冰冻红细胞直接置于生理盐水溶液中解冻，则红细胞将基本完全溶血。

例如Meryman液保存方法：

在1单位红细胞(约50ml)中加入160ml甘油保护剂，20分钟加完，室温放置30分钟后，直接放入-80℃冰箱。解冻时先在37-40℃快速融化，离心去除甘油，10分钟内缓慢加入9％高渗NaCl溶液80ml，静置3分钟后加入300ml羟乙基淀粉，混匀后，离心10分钟去上清，再加入150ml羟乙基淀粉和100ml生理盐水，1500g离心10分钟。去上清，加200ml生理盐水，1500g离心10分钟。去上清。冰冻和溶解洗涤总耗时约3小时。红细胞回收率约85％。

Huggins液保存方法：

冷冻方法同上。解冻方法使用和红细胞等体积(50ml左右)的50％葡萄糖溶液和1000ml5％果糖，离心10分钟。去上清，再加入5％果糖500ml，混匀后离心10分钟。去上清。同样方法再洗涤1—2次，至上清液中无明显溶血。耗时和回收率大体同上。

这种将红细胞先悬浮在高渗透压冻存保护液中再用不同渗透压的洗涤液逐次洗涤的方法，其主要缺点是过程比较复杂，且耗时。因此本领域迫切需要开发简单、省时的细胞保存方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的长期冰冻保存红细胞的简单方法，该方法解决了现有试剂红细胞冻存技术繁琐、耗时等问题。

本发明的目的之二是提供一种与上述冰冻保存红细胞的方法相适应的红细胞解冻方法。

同时，本发明还提供了上述方法所使用的红细胞冰冻保护液和洗涤液。

本发明利用含有DMSO(二甲基亚砜)的高渗的保存液，配置成红细胞冰冻保护液。该冰冻保护液悬浮红细胞时，可以使红细胞进入高渗状态。同时由于冰冻保护液中含有大分子胶体物质，可以相对锁住水份，降低溶质扩散速度，因此当红细胞与高浓度DMSO快速混合时，不会大量溶血。另外大分子胶体物质还可以抑制红细胞外冰晶对红细胞膜的破坏作用。整个冰冻过程大约1分钟

在解冻时，含有大分子胶体物质的洗涤溶液可以减慢红细胞脱DMSO的速度，因此可以使用不含DMSO的洗涤液直接洗涤融解的红细胞，而不会导致快速溶血。然后通过离心去除大分子胶体物质，即可配成红细胞盐水悬液用于相关试验，整个融解过程大约15分钟。红细胞的最终得率可达到90％左右。

本发明一方面公开了一种红细胞冰冻保护液，为含有生物相容性大分子物质和DMSO的高渗溶液，大分子物质的分子量在20000-400000道尔顿之间，单一大分子物质的重量比体积百分比浓度(W/V)为2-10％。

高渗溶液是指：溶液中的溶质颗粒(包括未离解的分子和已离解的离子)总浓度明显高于正常人血浆渗透压的溶液，例如明显大于300mMol/L(渗透压单位300mOsm/L)，称为高渗透溶液。

DMSO一般浓度(W/V)为10％—40％，—20℃冰箱冻存优选15％—25％，—80℃冰箱冻存优选20％—30％，25％最佳。

本发明另一方面公开了一种红细胞冰冻洗涤液，为含有生物相容性大分子物质的基本等渗的溶液，生物相容性大分子物质的分子量在20000-400000道尔顿之间，单一大分子物质的重量体积百分比浓度为2-10％。