[发明专利]胚胎源性多能干细胞向心脏起搏细胞定向诱导分化的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及干细胞诱导分化技术领域，是利用胚胎源性多能干细胞进行诱导分化为心脏起搏细胞的方法及其应用。

背景技术：

构建生物心脏起搏器的方法可以分为基因治疗和细胞移植两种。以基因治疗为基础的方法是将特定的基因直接导入心脏来创建或提高其自动节律，然而，转染起搏基因虽然提高和产生了心肌细胞的自律性，初步证明可以构建生物心脏起搏器，但依然面临巨大的挑战，如外源基因在体内缺乏长期稳定的表达并且难以有效的调控；不能得到高效、安全、导向性好的载体系统等。利用细胞移植的方法构建生物心脏起博器理论上可以克服上述基因治疗的局限性，该方法是将具有起博活性的细胞移植到心脏，代替和修复宿主缺损的起博细胞，达到重新恢复心脏正常起搏能力的目的。但由于成体窦房结细胞供体来源困难，植入心脏后适应微环境的能力差，故目前细胞治疗主要是以胚胎源性干/祖细胞和成体间充质干细胞作为细胞来源(Richard B.Robinson，et al.2006，If and the biological pacemaker)。然而由于缺少心肌细胞特异的离子电流，间充质干细胞较难诱导为起搏细胞，一般作为移植治疗中携带基因的载体，严格意义上还属于基因治疗的范畴。胚胎源性干/祖细胞中，胚胎干细胞在诱导为具有起搏活性的细胞方面则较有优势。目前已有报道从胚胎干细胞形成的类胚体中得到自发跳动的细胞，并将这些细胞移植到心脏的特定区域构建起搏器；结果表明移植区有自主心律，并对神经性调节有自动反应性。但是，胚胎干细胞来源的起搏细胞具有向终末成熟心肌细胞分化的性质，而一旦分化为终末细胞则失去起搏特性，因此精确控制干细胞分化并终止于窦房结细胞阶段是一个难题。此外胚胎干细胞存在免疫原性、致瘤性、伦理道德等问题也是阻碍其应用的重要因素。

胚胎源性多能干细胞是存在于骨髓中的一种与胚胎干(ES)细胞近似的干细胞群，表达ES特征性的表面标志，具有强大的增殖能力和多向分化潜能(Kucia M，et al.2007，Morphological and molecularcharacterization of novel population of CXCR4⁺SSEA-4⁺Oct-4⁺verysmall embryonic-like cells purified from human cord blood)。至今未见利用该细胞定向诱导分化心脏起搏细胞构建生物心脏起搏器的相关报道。

发明内容：

本发明的目的是利用胚胎源性多能干细胞定向诱导分化心脏起搏细胞，用于生物心脏起搏器的构建。

本发明的关键在于如何诱导胚胎源性多能干细胞分化为具有稳定活性的起搏细胞，如何精确控制干细胞分化并终止于窦房结细胞阶段。

根据早期胚胎心脏发育过程中起搏细胞的分化条件(多种微环境条件和关键基因)的研究，内皮素-1和神经调节蛋白-l等旁分泌因子是心脏早期起搏细胞分化成熟的微环境条件之一(Dirk L.Brutsaert.2002，Cardiac Endothelial-Myocardial Signaling：Its Role in CardiacGrowth，Contractile Performance，and Rhythmicity.Stacey Rentschler，etal.2002，Neuregulin-1 promotes formation of the murine cardiacconduction system)。除了旁分泌信号促发作用外，在诱导干/祖细胞向起搏细胞方向分化的过程中，胞外基质组分是需要考虑的一个重要因素(Baharvand H，et al.2005，The effect of extracellular matrix onembryonic stem cell-derived cardiomyocytes)。此外，心脏三个起搏基因HCN1、HCN2、HCN4中，在起搏细胞中主要存在的是HCN4，在起搏细胞的发育分化成熟中HCN4起重要作用(Juliane Stieber，et al.2003，Thehyperpolarization-activated channel HCN4 is required for the generation ofpacemaker action potentials in the embryonic heart)。

鉴于上述情况，本发明提供一种胚胎源性多能干细胞向心脏起搏细胞定向诱导分化的方法，该方法包括：