[发明专利]均相免疫分析纳米器件的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种均相免疫分析纳米器件的构建方法，基于化学发光共振能量转移原理，构建用于均相免疫分析的纳米器件，属于生物分子纳米器件制备和生物分析技术领域。

背景技术

免疫分析是基于抗体和抗原特异性结合反应而建立的一种高选择性的分析方法，它被广泛地用于临床分析，食品分析，环境分析等领域。目前免疫分析主要采用荧光，化学发光和放射等检测手段。其中化学发光检测具有检测仪器简单，灵敏度高等特点，但选择性差，本体溶液自发光干扰较大。另外，目前免疫分析主要采用非均相模式，需要多步繁琐的操作如涂板，分离，清洗，分析时间长。

液相法(或称为均相法)的免疫反应和信号测定在溶液中一步完成，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单，其中均相荧光免疫测定应用最为广泛。目前均相荧光免疫分析是基于荧光共振能量转原理。

荧光量子点(quantum dots，QDs)是一种由II族-VI族或III族-V族元素组成的无机纳米颗粒，与传统荧光探针相比，它具有激发光谱宽，发射光谱窄并且呈对称分布，通过调节组成和大小可以使其发射出不同颜色的光等特点，量子点作为荧光探针标记生物分子的研究已经用于细胞成像，免疫分析，DNA杂交等方面。传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供体和受体发射光谱产生相互干扰，限制了荧光共振能量转移在均相免疫分析中的应用。最新的一些报道将发光量子点用于荧光共振能量转移免疫分析中，克服了有机荧光染料的不足之处。Goldman等人(Goldman，E.R.；Clapp，A.R.；Anderson，G.P.；Uyeda，H.T.；Mauro，J.M.；Medintz，I.L.；Mattoussi，H.Multiplexed Toxin Analysis Using Four Colors ofQuantum Dot Fluororeagents，Anal.Chem.2004，76，684-688)基于免疫反应，通过荧光共振能量转移，采用四种不同发射波长的荧光量子点实现了对四种毒素的同时检测。

但是荧光共振能量转移分析系统结构复杂，仪器价格昂贵。另外，生物体内自身荧光会增加背景的干扰，其应用受到一定的限制。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种均相免疫分析纳米器件的构建方法，构建的免疫分析纳米器件不需要外加激光光源，发射波长可调，具有良好的水溶性和稳定性，通过化学发光共振能量转移产生强的光信号，可用于均相免疫分析。

为实现这一目的，本发明基于化学发光共振能量转移(chemiluminescenceresonance energy transfer，CRET)原理构建免疫分析纳米器件，这种纳米器件由过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、免疫复合物和能量受体纳米粒子碲化镉量子点组成，是以一种基于化学发光共振能量转移原理发光的碲化镉量子点为核心，经碲化镉荧光量子点与抗原或抗体以静电或共价作用连接，过氧化物酶与抗体共价连接，基于抗原-抗体免疫反应的生物纳米器件。

本发明的方法具体包括如下步骤：

1.碲氢化钠制备：

将摩尔比为1∶4至4∶1的硼氢化钠和碲粉置于水中，在0-50℃下反应，生成碲氢化钠溶液。

2.水溶性碲化镉量子点的合成：

将0.00001-0.1摩尔/升氯化镉和水溶性巯基化合物混合配成溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值至8.0-10.0，通氮气除氧三十分钟后，在剧烈的搅拌并在氮气保护下，注入碲氢化钠溶液，形成碲化镉单体溶液。碲化镉单体溶液中二价镉离子∶碲氢化钠∶水溶性巯基化合物的摩尔比为2∶1∶4至2∶1∶8，控制碲化镉单体溶液的反应温度为70-140℃，反应时间0.5-20小时，得到发光范围在500到750纳米的一系列碲化镉量子点水溶液。

3.水溶性碲化镉量子点-抗原(或抗体)生物标记物溶液的制备

将0.001-5毫克/毫升碲化镉量子点，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、抗原(或抗体)，置于0.01摩尔/升、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中混合均匀，碲化镉量子点、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐、抗原(或抗体)的摩尔比为1∶100∶0.2至1∶1000∶6，将混合溶液于常温下避光反应2-4小时。采用超滤法纯化得到碲化镉量子点-抗原(或抗体)生物标记物溶液。最后置于4摄氏度冰箱处保存备用。

4.过氧化物酶和抗体(或抗原)的共价连接。