[发明专利]人吲哚胺2,3－双加氧酶多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体及其制备方法，以及人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体在免疫印迹和免疫组化中的应用。

背景技术

人吲哚胺2，3-双加氧酶(Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)是一种广泛存在于哺乳动物体内的除肝脏外的细胞胞浆中的血红素蛋白，为色氨酸代谢过程中的重要限速酶。它能氧化断裂生物体的必需氨基酸--色氨酸的吲哚环的2-3双键，在体内迅速氧化成犬尿氨酸，进而变成一系列的代谢产物。编码IDO的基因位于人的8号染色体，包含10个外显子，全长15kb。它含有2个干扰素(interferon，IFN)刺激反应元件(interferon stimulatingreaction element，ISRE)，5′端还包括干扰素调节因子-1(IFNregulation factor，IRF-1)结合区域，表明IFN能影响IDO的表达。

二十世纪中期，人们对于IDO的研究主要集中于蛋白的提纯、催化作用的动力学基础和抑制病原微生物的情况。当时的研究表明，机体组织受到感染时，白细胞和淋巴细胞会聚集在感染部位，释放IFN，从而诱导局部组织细胞内IDO的表达。这种诱导能抑制细菌、病毒、寄生虫和肿瘤的生长，其原因是IDO的催化作用使感染部位的周围形成了色氨酸缺乏的微环境，使病原微生物和肿瘤因缺乏色氨酸这种增殖必需的氨基酸而死亡。

二十世纪末，越来越多的研究表明IDO在机体免疫调节中起了非常重要的作用。人们发现IDO高表达于母体胎盘，其他表达量较高的组织有小肠，淋巴结，脾，胸腺和肺。在David Munn等人的实验中，他们发现胎盘的滋养层具有抑制母体T细胞，使胎儿免受母体的免疫排斥反应的能力，而这种能力正是滋养层细胞中表达丰富的IDO所赋予的；给怀孕母鼠服用IDO抑制剂1-MT造成母鼠流产这一事实也强有力地说明了这一点。近年来大量的研究表明IDO在肿瘤免疫耐受中起着重要作用，肿瘤细胞和抗原呈递细胞中IDO的表达与肿瘤的发生发展密切相关。在抗肿瘤免疫反应的起始阶段，肿瘤引流淋巴节在受细胞因子的刺激下会产生表达IDO的树突状细胞(dendritic cells，DCs)的亚群，通过细胞表面接触引起的信号传递能使T细胞进入无能状态(anergy)，从而无法激发有效的抗肿瘤免疫反应。在抗肿瘤免疫反应的效应阶段，许多肿瘤细胞也被发现自身能表达IDO，IDO的过度表达会使局部色氨酸代谢活动加剧，其结果是局部色氨酸浓度的下降和有毒性的犬尿氨酸代谢产物的积累，使对这种环境敏感的效应T细胞死亡而无法发挥杀伤性作用，同样的情况也很可能发生在肿瘤引流淋巴结内。当人们用IDO特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan，1-MT)来抑制DC或肿瘤细胞内的IDO时，人们发现T细胞的抗肿瘤反应能力明显增强。

综上所述，对细胞内IDO表达的研究在探讨IDO在免疫调节中的作用具有重要意义，由于IDO的表达与肿瘤治疗效果存在一定的联系，在肿瘤治疗中对IDO表达的检测有助于对治疗方案做进一步的改善。但国内尚无关于相关抗体研制的报道。

发明内容

本发明的一个目的是填补国内人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体的技术空白，提供一种IDO多克隆抗体，将人IDO基因克隆至原核表达质粒中，并在大肠杆菌中大量表达并纯化，经免疫家兔，以得到特异性好，浓度高的抗体，从而能大量制备出廉价的、高质量的抗人IDO抗体。在各种细胞和组织中应用所制备出的抗体检测IDO的表达情况，为进一步研究IDO在机体免疫系统中发挥的作用奠定基础。

本发明的另一个目的是提供所述人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体的具体制备方法，简单易行，制备成本低。

本发明还有一个目的是提供了所述人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体的应用。

本发明的技术方案是提供一种人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体，将人IDO基因克隆至原核表达质粒中构建重组质粒，表达并纯化后经免疫家兔得到。

所述重组质粒主要包括His表达标签，全长为1212bp的hIDO的cDNA，相应编码蛋白质有43个氨基酸。

所述重组质粒表达并纯化后的融合蛋白分子量为50KD。

本发明提供了所述人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)pET30a(+)-hIDO重组质粒的构建；

(2)His-hIDO融合蛋白的表达和纯化；