[发明专利]一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用。

背景技术

内切葡聚糖酶(β-1，4-内切葡聚糖酶，Endoglucanase/Endo-1，4-β-Glucanase，EC3.2.1.4)是纤维素酶酶系的重要组分，可将纤维素分子从内部即在β-1，4糖苷键将其切断。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它往往不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，它除了内切葡聚糖酶外，还包括外切葡聚糖酶(β-1，4-外切葡聚糖酶，Cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(BG，β-Glucosidase，EC3.2.1.21)。按催化反应的最适pH值，内切葡聚糖酶可以分为酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究最早，然而，随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性内切葡聚糖酶也显现出诸多不足，如碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性较差、pH值适应范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生退色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。

碱性内切葡聚糖酶(又名碱性纤维素酶)主要由细菌产生。与由真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，由细菌产生的碱性内切葡聚糖酶具有其独特的优越性：(1)pH值适应范围广，一般在pH值6～10之间均具有较高的活性；(2)热稳定性好，可以耐受60℃的高温；(3)酶成分单一，主要酶活性成分为内切葡聚糖酶，便于工业应用；(4)可用细菌发酵生产，发酵周期短；(5)可以承受很高的pH值，作为洗涤用酶可使衣物经多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳；(6)可以在中性环境中处理纺织品，不会造成纺织品退色等。因此，就洗涤剂、纺织等工业而言，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶有着传统酸性内切葡聚糖酶无可比拟的优越性。

内切葡聚糖酶基因的克隆是深入研究酶作用机制及高产工程菌株构建的基础。1986年，Fukumori等首次报道了芽孢杆菌Bacillus sp.Strain 1139的碱性内切葡聚糖酶基因的克隆和测序(Fukumori F，Kudo T， Narahashi Y，et al.JGen Microbiol，1986，132：2329～2335)。目前，国外共有近20个左右碱性内切葡聚糖酶基因被克隆和测序，其中大部分来源于芽孢杆菌。国内对细菌内切葡聚糖酶基因的研究相对滞后，尚未能达到产业化水平。就目前国内有关碱性内切葡聚糖酶的研究水平来看，主要问题在于：(1)酶活性还比较低，在国内还不能达到工业化生产水平的要求；(2)对酶的纯化、酶学性质研究还很少，特别是对酶在洗涤剂中的性质研究很少，缺乏具有实际应用价值的酶；(3)对酶基因的研究不够深入。这些都阻碍了碱性内切葡聚糖酶的工业化生产应用。因此，当前迫切需要解决的问题主要有两个：首先是提高产酶水平，可通过现代基因工程的方法构建基因工程菌株，以提高酶产量；其次，通过基因工程寻找酶学性质更优并可在洗涤剂及纺织等领域能实际应用的重组酶。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a的基因序列及其氨基酸序列。本发明根据酶蛋白质谱分析所得的肽段及其同源序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出碱性内切葡聚糖酶的酶基因III-3-a。

本发明的另一目的在于提供一种重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1。该重组酶III-3-A1比天然酶在洗涤剂中的稳定性更强。

本发明的再一目的在于提供上述重组碱性内切葡聚糖酶III-3-A1的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a，所述酶基因序列如表1所示(也即序列表SEQUENCE LISTING NO.1所示的基因序列)：