[发明专利]一种蛇毒抗原－抗体反应定量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化领域中一种抗原-抗体反应定量测定的方法，尤其是涉及一种蛇毒抗原-抗体反应定量测定的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法。

背景技术

毒蛇的毒素(蛇毒)是一个巨大的生物资源宝库。自1963年英国人Reid第一次发现马来西亚红口蝮中含有引起纤维蛋白原下降的类凝血酶以来，蛇毒的综合利用开发日益受到人们的重视。1968年英国人研制成功了蛇毒制剂ARIN并首先投放市场，以治疗血管闭塞性疾病。近年来，随着多达数十种蛇毒产品(药品)面世，并且取得了不俗的临床疗效和销售业绩，蛇毒的开发利用正在成为国际生物学家、药学家及制药企业争相追逐的新热点。

除了蛇毒及其制剂之外，在抗蛇毒血清及IgY的研发、制备过程中，抗原、抗体的质量检验无疑是关键步骤之一。利用已知蛇毒检测待测抗体的效价及交叉免疫活性，或以已知抗体检验待测蛇毒的组分及杂质含量的方法有多种，其中蛋白质印迹(Westernblotting)技术无疑是目前最常用的方法之一。蛋白质印迹技术是在SDS-PAGE与固相免疫测定技术(ELISA)结合的基础上发展起来的，其主要操作过程可分为电泳、转印、酶免疫测定三个阶段：抗原先经SDS-PAGE或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后用抗体对膜表面的抗原进行特异性免疫识别，再加入第二抗体及生色底物反应后，即可根据抗原显示的位置及色度定量分析抗体的特异性和敏感性。Western blotting在蛇毒、抗蛇毒抗体的质量检验的实际应用中还存在一定不足，如在转印过程中不可避免地损失了部分抗原，而且酶免疫的显色剂DAB有强致癌的潜在可能；并且在抗原和抗体有杂质时，检验的分别率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、安全的蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，该方法可避免因转膜而致抗原损失而影响实验结果；而且该方法不受检验样品的纯度影响，具有极高的分辨率。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种蛇毒抗原-抗体反应定量测定的方法，它包括以下步骤：

(1)制备蛇毒抗原和抗体；

(2)将蛇毒抗原和抗体混合后置于全温振荡器中在35～45℃的温度下进行预孵育，整个预孵育过程分为先振荡后静置两个时段；

(3)在经过预孵育的抗原-抗体溶液中加入上样缓冲液，在100℃反应5～15min，离心，得到的上清液即为样品液；

(4)使用SDS-PAGE电泳法对样品液进行电泳及显色，然后根据泳道染色条带的密度、迁移及消失的变化来定量分析蛇毒抗原-抗体反应特性。

本发明步骤(2)中所述的预孵育温度为35～45℃，优选为38℃。

本发明步骤(2)中所述的振荡时段的振荡时间为10～20min，振荡速度为80～120rpm/min；静置时段的时间为20～40min。因为适宜振荡能促进抗原-抗体的结合率，但振荡时间不宜过长，过长时间的振荡会使抗原-抗体结合后再解离，影响实验的准确性。振荡后的溶液静置促进在振荡期形成的抗原-抗体复合物聚合为更大的团块，然后通过离心去除。

本发明步骤(2)中所述的抗原和抗体混合根据不同的检测目的，分为以下四种形式：

①测定抗原/抗体最佳结合比例：定量标准蛇毒抗原与变量标准蛇毒抗体混合；

②测定抗体的稳定性等特性：定量标准蛇毒抗原与定量标准蛇毒抗体混合；

③测定共同抗体及特异性抗体，反之则测定共同抗原及特异性抗原：不同种、属的标准蛇毒抗原与单一标准蛇毒抗体混合；

④测定非标准蛇毒的种、属及杂质含量，或者测定非标准蛇毒抗体的效价及其它免疫特性：定量标准蛇毒抗体与变量非标准蛇毒抗原混合。

为既能够提高分辨率，又不会超出电泳设备的最大负载影响实验结果的可靠性，在本发明所述的步骤(3)中上样缓冲液的组成为：100mmol/L Tris.HCL(pH 6.8)；4％SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油；加入上样缓冲液后，控制抗原-抗体溶液中抗原的终浓度为1～12ug/ul，抗体的终浓度为3～35ug/ul。

本发明步骤(3)中所述的离心速度为5～15min，优选为10min；离心速度为10000～14000g/min，优选为12000g/min。离心可将抗原-抗体聚合物及大分子的复合物去除，而保留了小分子的复合物及未形成复合物的抗原、抗体，便于后期的电泳分析。但是离心速度不宜过快，过快会过多去除小分子复合物反而影响结果的可靠性。