[发明专利]棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法

说明书

一、技术领域

本发明棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法，属于植物组织培养范畴，适用于棉花体细胞培养和农杆菌介导基因转化的受体材料的培养技术。

二、技术背景

虽然棉花体细胞培养、花药培养、胚珠和胚培养、原生质体培养等植株再生的技术体系早已建立，但至今在应用方面仍受到相当程度的限制。现有的棉花组织培养植株再生技术，都是通过愈伤组织的诱导和增殖、胚状体的发生和萌发、壮苗培养、试管苗生根途径获得再生植株，每一个阶段都需要特定的培养条件，培养过程复杂，培养周期长，且愈伤组织在长期继代培养过程中易产生染色体变异，产生大量的异常胚状体，在获得的试管苗中畸形苗所占的比例偏高。

迄今为止，国内外有关从棉花子叶离体培养诱导不定芽再生植株的报道仅有2篇(吴敬音，佘建明等.泗棉3号叶片丛生芽形成及植株再生[J]，江苏农业科学，1994，2；张海，易永华等.棉花子叶离体培养与植株再生[J]，西北农业学报，2002，11(1)：84～86)。吴敬音等以5～7d苗龄的子叶为外植体材料，从陆地棉泗棉3号品种偶尔诱导产生不定芽，不但诱导率低，且试验重复性差；张海等则是首先通过子叶诱导产生愈伤组织，然后再经过愈伤组织分化的途径而得到再生植株。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是要克服目前在棉花组织培养植株再生技术中存在的培养过程复杂、周期长、畸形胚和畸形苗比例高、植株再生率低等问题。以棉花种子无菌苗的子叶为外植体材料，直接从完整子叶的基部切口处诱导不定芽发生，从而建立起棉花子叶离体培养不定芽诱导高频率植株再生技术。

技术方案

棉花子叶离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于，

1)材料

选用棉花种子无菌苗的子叶为外植体材料；

2)培养基

基本培养基：由MS大量元素、MS微量元素与B₅维生素组成，葡萄糖30g/L，固化剂-phytagel 2g/L；

不定芽诱导培养基附加激素：6-苄基氨基嘌呤3.0mg/L，吲哚乙酸1.0mg/L，2-异戊烯腺嘌呤1.0mg/L；添加硝酸银5.0mg/L；

幼苗生长培养基：在上述基本培养基中添加6-苄基氨基嘌呤0.1mg/L；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

3)培养方法

经硫酸脱绒的棉花种子在70％乙醇中消毒2～3min，然后用10％双氧水处理30～60min，表面消毒处理后的种子在25℃下无菌水中浸泡24h，剥去种皮后置于1/2MS培养基上，15h后切取完整的子叶接种在不定芽诱导培养基上；10d后从子叶的基部切口处诱导产生不定芽，不定芽长到1.5cm高度时转到幼苗生长培养基上，获得再生植株。培养室温度为25±1℃，在16h光照条件下培养。

有益效果 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

本发明以珂字棉312品种和陆地棉泗棉3号品种的种子无菌苗15h苗龄的子叶为外植体材料，在附加6-苄基氨基嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸1.0mg/L和2-异戊烯腺嘌呤1.0mg/L不定芽诱导培养基上，不定芽的诱导频率分别达40％和30％以上。陆地棉泗棉3号品种的子叶诱导不定芽总的频率为30％以上，其中发育正常的不定芽的频率在16％以上。在上述不定芽诱导培养基上添加硝酸银5.0mg/L，珂字棉312品种不定芽的诱导频率达70％左右，陆地棉泗棉3号品种不定芽的诱导频率达60％左右。由此，本发明成功地建立起棉花通过子叶离体培养诱导不定芽途径高频率植株再生技术体系。

本发明从棉花种子的无菌苗15h苗龄的子叶直接诱导产生不定芽，由不定芽发育成试管植株，极大地简化了现有的棉花组织培养植株再生的培养方法，培养条件操作简便，培养周期缩短4～6个月，并提高了植株再生的频率，为规模化开展体细胞培养和农杆菌介导基因转化提供崭新的、更为有效的实用技术。

四、附图说明

图1接种15h苗龄的子叶

图2子叶诱导产生不定芽

图3试管苗

图4完整再生植株

五、具体实施方式

1.材料和方法

1.1实验材料

珂字棉312、陆地棉泗棉3号品种为试验材料。

取种子无菌苗的子叶为外植体材料。

1.2培养基