[发明专利]亚硝酸测定试剂盒及亚硝酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种亚硝酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚硝酸浓度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

亚亚硝酸盐主要指亚亚硝酸钠，亚亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水。外观及滋味都与食盐相似，并在工业、农业、食品、建筑业中广为使用，由亚亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高。1995年版中华人民共和国药典对蒸馏水检测增加了亚硝酸盐与亚亚硝酸盐检查。亚亚硝酸盐可被氧化变为亚硝酸盐，亚硝酸盐在无氧环境中受微生物的作用还原为亚亚硝酸盐，是致癌物质。

目前有按照国标GB/T 5009.33做成的试剂盒，与标准色卡来比较进行定量，然而按照国标方法检测亚亚硝酸盐指标，步骤繁琐，而且有些试剂必需现配现用，费时又费力。它的检测原理：在酸性溶液中亚亚硝酸盐与对氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，再与α-萘胺起偶合反应，生成紫红色偶氮染料，显色深浅与亚亚硝酸盐含量成正比。加入锌粉的目的是将亚硝酸盐还原成亚亚硝酸盐。

紫外分光光度法的原理：亚硝酸根离子在紫外区有强烈的吸收，利用它在220nm波长处的吸光度可定量测定亚硝酸盐。氯化物在此波长不干扰测定，溶解的有机物在220nm处也会有吸收，而亚硝酸根离子在275nm处没有吸收。因此，在275nm处作另一次测量，以校正亚硝酸盐值。紫外分光光度法操作过程简单。

还有利用离子色谱法紫外测定海水中亚亚硝酸盐、亚硝酸盐，这是利用离子色谱法结合紫外检测的方法。其他还有主要对肉制品、乳制品和蔬菜中亚亚硝酸盐检测的光度法(格里斯试剂比色法、催化(褪色)光度法、流动注射-分光光度法、顺序注射-分光光度法、导数光度法)、示波极谱法、荧光法等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定亚硝酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的亚硝酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行亚硝酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明亚硝酸浓度测定方法原理如下：

亚硝酸+水+辅酶硝酸还原酶硝酸+还原型辅酶

这种方法应用硝酸还原酶(Nitrate reductase；EC 1.7.1.1；EC 1.7.1.2；EC1.7.99.4)酶促反应连续监测法/终点比色法。硝酸还原酶酶解亚硝酸反应，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算亚硝酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明亚硝酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液    100mmol/L

稳定剂    500mmol/L

辅酶          3mmol/L

硝酸还原酶    10000U/L

本发明的亚硝酸测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、硝酸还原酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、硝酸还原酶。

辅酶、硝酸还原酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂，本发明测定亚硝酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的亚硝酸测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

辅酶                             3mmol/L