[发明专利]一种产生抗肿瘤化合物Norharmane的海洋放线菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生抗肿瘤化合物的海洋放线菌WBF9的鉴定和发酵，以及抗肿瘤化合物的分离纯化和细胞毒活性，属于微生物药物领域。

背景技术

众所周知，陆地放线菌是抗菌、抗肿瘤以及免疫抑制剂等多种药物的重要来源。但是随着时间的推移，从陆生放线菌中发现新化合物的几率越来越低，结果白白耗费了大量的人力物力，因此有必要开发新的药物资源。近年来，海洋放线菌逐渐成为药物开发的重要源泉，由于其生活在高盐、高压、低温和低营养的特殊环境中，能产生很多结构独特。作用新颖的化合物，具有陆地微生物无法比拟的优势。从海洋放线菌中分离到新活性化合物的数量逐年增多，包括了很多活性很高的细胞毒化合物，其中thiocoraline、salinosporamide A和ECO-4601已经进入临床研究。因此，海洋放线菌作为一种细胞毒化合物的新来源，已经引起广泛的关注。

为了能够从海洋放线菌中分离到新的化合物，本实验室已经从威海海洋样品中分离到116株放线菌，并筛选到一株抗肿瘤活性很好的放线菌WBF9。通过传统分类和16S rDNA基因分析，将其鉴定为灰略红链霉菌的一个新菌株；从其发酵液中分离到一个具有细胞毒活性很高的化合物，并对该化合物的抗肿瘤活性进行了初步的研究。

发明内容

本发明的目的是鉴定海洋放线菌WBF9，从其发酵液中分离抗肿瘤化合物，并且研究该化合物的细胞毒活性。

本发明涉及海洋放线菌的鉴定，即经过传统分类和16S rDNA基因分析，将其鉴定为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)的一个新菌株，菌株WBF9是首次从海洋中分离到的灰略红链霉菌。

菌株WBF9应用培养基(葡萄糖1％，土豆15％，酵母粉0.6％，氯化钙0.12％，天然海水，pH7.2)进行发酵，从其发酵液中分离提取到抗肿瘤活性很强的化合物，经MS和NMR技术将其鉴定为Norharmane，是首次从海洋放线菌中分离到该化合物。

通过MTT法，发现该化合物对四种肿瘤细胞KB、BGC 803、Hep G2和SGC 7901具有很强的细胞毒作用。

附图说明

图1是海洋放线菌WBF9的孢子链结构，(a)光镜(×400)(b)扫描电镜(×7000)

图2是以16S rDNA为基础构建的N-J进化树

图3是放线菌WBF9的发酵时效曲线

图4是抗肿瘤化合物Norharmane的结构示意图

图5是抗肿瘤化合物Norharmane作用后，BGC803肿瘤细胞的形态变化(×100)，a、b、c和d分别为Norharmane 2.8、4.2和5.6μg/mL，以及阴性对照

具体实施方式

实施例1

1、采用插片法在高氏合成一号培养基上培养WBF9，在Olympus BH-2光学显微镜下观察菌丝体(×400；图1a)，在AKASHI SX-40扫描电镜下观察孢子丝和孢子形态(×7000；图1b)。结果见图1，孢子链呈现规则的螺旋型，每个孢子链有4-8个螺旋，有10个以上孢子；所有孢子表面都有短刺，孢子呈现圆形或者卵圆形；孢子直径约0.5-1.0μm，长约0.6-1.4μm，由此可以判断该菌株是链霉菌属。

2、依照国际链霉菌计划(ISP)及Waksman所推荐的培养基配方对海洋菌株WBF9进行培养，并观察培养特征和生理生化特性。

菌株WBF9的培养特征：菌株WBF9在典型的放线菌鉴别培养基上培养(即：酵母麦芽膏琼脂、燕麦琼脂、淀粉无机盐琼脂、蛋白胨酵母粉琼脂、酪氨酸琼脂、葡萄糖天冬氨酸琼脂、高氏合成琼脂、土豆条培养基)。菌株在多数培养基上生长良好，孢子堆呈现灰色，无可溶性色素产生。

菌株WBF9的部分生理生化特征：能液化明胶、使牛奶凝固和胨化、水解淀粉、降解纤维素，但是不能产生黑色素、硫化氢。能够利用葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖和肌醇，不能利用蔗糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。

3、采用Lechevalier全细胞壁制备方法及王平快速薄层分析法对全细胞壁氨基酸和糖组份进行分析。结果发现，菌株WBF9细胞壁中只含L，L-二氨基庚二酸(L，L-DAP)；无特征性糖，属于细胞壁I型，糖型C，与链霉菌的细胞壁特征相同。