[发明专利]重组人中期因子(rh－Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及人中期因子MK的原核表达、单克隆抗体的制备及其应用。 

背景技术

1988年日本学者Kadomatsu等在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中发现Midkine(MK)基因，中文称为中期因子。早期研究发现中期因子是一种对细胞的生长和分化起重要作用的细胞因子。它能促进正常细胞的生长和分化，尤其可促进神经细胞的发育。近年对人肿瘤研究发现，MK具有诱导细胞转化、促有丝分裂、生血管、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等与肿瘤发生与发展密切相关的生物学功能，且在多种肿瘤组织中均有异常表达。 

Konishi等对15例潜伏期前列腺肿瘤、16例PIN(膀胱上皮内瘤形成)及正常前列腺组织进行了免疫组化分析研究显示，80％潜伏期肿瘤和75％PIN有MK高度表达，而正常组织不表达或仅微弱表达MK。在结直肠癌的早期发生中，伴中度或重度发育异常的腺瘤，MK表达均明显高于轻度异常或正常组织。 

本实验室通过RT-PCR和免疫组化的方法，检测9例正常胃镜组织、37例胃肿瘤组织及其相应的配对癌旁组织中MK的表达情况，对MK的表达进行定性、定量和定位分析，并进一步分析了MK表达水平与肿瘤临床病理之间的关系。RT—PCR定性分析表明，MK在胃癌组织中高表达(表达率为94.6％)，癌与癌旁MK表达有显著差异，而且癌与正常组织有显著差异；RT-PCR定量分析结果证实了定性分析的结果，而且发现MK的表达与肿瘤的临床分期及远处转移情况相关，而与肿瘤的组织分化、大小及淋巴结转移情况无关；免疫组化定位分析发现，MK蛋白广泛存在于肿瘤细胞的细胞质，此外，细胞核和核仁也有MK聚集，细胞外组织中腺泡处MK表达尤为明显。 

国内外的研究结果均表明：MK与肿瘤的发生与发展密切相关，MK的表达与肿瘤发展的进程及严重程度也密切相关。而且由于MK在肿瘤形成的早期就有异常表达，MK检测将有可能应用于肿瘤的早期诊断。 

由于目前尚缺乏特异性强的MK单克隆抗体检测和靶向治疗肿瘤的MK单克隆抗体药物，临床上对MK的免疫学检测都是用多克隆抗体，在检测过程中存在交叉反应、特异性低等不可避免的缺点。正是因为没有特异性高的人MK单克隆抗体，所以对MK的检测特别是血液、尿液中MK的检测受到了相当大 的限制。本发明得到了一株特异性高的单克隆抗体，证明本发明可以用于肿瘤组织、血液、尿液中MK的特异性检测。并可以通过特异性结合MK而靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞。 

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抗MK蛋白的单克隆抗体。 

本发明的另一个目的是提供一种特异性检测肿瘤病人血液、尿液和组织的检测试剂盒。 

本发明的另一个目的是提供一种能靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞的单克隆抗体偶联物。作为靶向富含MK蛋白肿瘤细胞的治疗剂。 

在本发明的第一个方面，提供了一种免疫球蛋白IgG1，其特征在于，它能特异性结合MK蛋白，所述MK蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。 

在本发明的一个实例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。 

在本发明的另一个实例中，所述的免疫球蛋白由小鼠杂交瘤细胞系9E10所产生，这种免疫球蛋白还包括人源化改造的MK单克隆抗体。 

本发明的第二个方面，提供了能检测肿瘤组织中的MK蛋白含量的试剂盒，它含有上述免疫球蛋白或与这种免疫球蛋白形成的偶联物，其特征是该免疫球蛋白偶联物具有特异性结合MK蛋白的免疫球蛋白或活性片段及可以将药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、荧光素、纳米材料分别偶联到免疫球蛋白或活性片段上的偶联物。 

本发明的第三方面，提供了上述免疫球蛋白或免疫球蛋白偶联物作为一种药物组合物，其特征是可靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤组织。 

附图说明

图1显示的是经过表达、纯化的30P-MK的蛋白电泳分析。表明30P-MK为可溶性分泌表达，而且便于纯化。加样孔1指的是蛋白Marker，图左边标记的数字是对应条带的分子量；加样孔2是指未经过诱导的总蛋白上样，加样孔3是经过低温诱导的总蛋白上样，可以明显看出在17KD左右有明显的蛋白表达；加样孔4是指经过用1.2M洗脱液洗脱的蛋白电泳分析，可以看出还有一些少量杂蛋白；加样孔5是2M洗脱液的蛋白电泳分析，得到完全纯化的蛋白。